CLCF, nicht CrcB, schützt Pseudomonas putida ATCC 12633 bei starkem Fluoridstress.

Abbildung S2: Erstellung des pCLC^F Plasmide und Überprüfung der Koexpression mit den Delftia Fluoracetat-Dehalogenase. (A) Karte der konstitutiven mNeonGreen-Expressionsplasmide. Die Varianten mit niedriger (pSW002) bzw. höherer Kopienzahl (pSW003) unterscheiden sich ausschließlich durch die A246V-Mutation im RepA-Protein von pSW003. (B) Plasmidkarte für die konstitutive Expression der Pseudomonas syringae CLC^F von der P_psba Der Promotor wurde durch Einfügen des CLC erstellt.^F Gen anstelle des mNeonGreen-Gens (C) SDS-PAGE zur Überprüfung der Koexpression von CLC^F und Delftia Fluoracetat-Dehalogenase (DEF1) in P. putida ATCC 12633 + pBBR1-P_T5-DEF1 + pCLC^F-niedrig nach Wachstum auf 40 mM a-Fluorphenylessigsäure als einziges Kohlenstoffatom. Spezifische His-Tag-Färbung und Fluoreszenzbildgebung wurden wie in den Methoden beschrieben durchgeführt. Die beiden gezeigten Proben (Gesamtprotein der Zellen und Proteingrößenstandards) wurden auf demselben Gel aufgetragen, und das Originalbild wurde zu dem oben gezeigten Bild zusammengefügt.

Abbildung S3: Herstellung induzierbarer Expressionsvektoren für Pseudomonas spp. (A) Template für die PCR zur Amplifikation eines Fragments mit dem Arabinose-Operon, MCS und Terminatoren. Die grauen Pfeile in der Abbildung markieren die Annealing-Stellen für die PCR-Primer (Tabelle S1 ). (B) pBBR1MCS-2 wurde an den angegebenen Restriktionsstellen linearisiert, um das PCR-Fragment einzufügen. (C) Zusammengesetztes Plasmid mit dem BBR1-Replikationsursprung für Pseudomonas und dem induzierbaren Arabinose-Promotor sowie regulatorischen Elementen aus pBAD18. (D) Plasmid zur induzierbaren Expression von mNeonGreen. (E) Plasmid zur induzierbaren Expression von Wildtyp-CrcB aus P. putida ATCC 12633.

Abbildung S4: (A) Suizidvektor, der an den angegebenen Restriktionsstellen linearisiert wurde, um mutagene Fragmente einzufügen. (B) Mutagenes Plasmid mit einem aus NaF-adaptierten Stämmen amplifizierten Fragment, das das crcB-Gen mit einer Punktmutation sowie flankierende Regionen stromaufwärts und stromabwärts zur Erleichterung der homologen Rekombination enthält. (C) Mutagenes Plasmid, das aus PCR-Fragmenten des Wildtyps P. putida 12633 zusammengesetzt wurde, um eine interne In-Frame-Deletion in crcB zu erzeugen.

Abbildung S5: OD600 _{_max} , gemessen während der Adaptation des (A) +CLCF-niedrigen Stammes bzw. des (B) +CLCF-hohen Stammes an steigende NaF-Konzentrationen in LB-Medium. Die Fehlerbalken in Abbildung A geben die Standardabweichung von drei Replikaten an. Die Fehlerbalken in Abbildung B geben die Standardabweichung von drei Replikaten im Bereich von 25 bis 400 mM, von zwei Replikaten im Bereich von 425 bis 500 mM bzw. von Einzelkulturen im Bereich von 525 bis 550 mM an.

Abbildung S6: (A) Sequenzvergleich (Clustal Omega) der P _psbA -Promotorsequenzen auf CLC ^F- Expressionsplasmiden, die aus P. putida ATCC 12633-Stämmen isoliert wurden, die entweder nicht an das Wachstum in LB + 425 mM NaF adaptiert oder adaptiert waren. Die einzelne Nukleotidänderung (Kleinbuchstaben, fett) wurde sowohl auf den pCLC ^F -low- als auch auf den pCLC ^F -high-Plasmiden gefunden, die aus den adaptierten Stämmen isoliert wurden. (B) Wachstumskurven und (C) spezifische Fluoreszenz von P. putida-Zellen, die mNeonGreen unter der Kontrolle des konstitutiven Wildtyp- (WT) oder mutierten (Mut) konstitutiven P _psbA- Promotors exprimieren. Die Zellen wurden in LB + Tc in 96-Well-Platten kultiviert.

Abbildung S7: Normalisierte mNeonGreen-Fluoreszenz von P. putida ATCC 12633 + pBBR1- P _araBA mNeonGreen, kultiviert in LB-Medium mit 0.0–1.0 % L-Arabinose. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen von drei Replikaten an.

Abbildung S8: Wachstumskurven des Stammes P. putida ATCC 12633 crcB (?nt 55–363) + pBBR1- P _araBAD – crcB in LB + Km und 0, 5 oder 50 mM NaF. Das klonierte crcB -Gen wurde mit 0.0 % bis 0.5 % L-Arabinose induziert, die dem Medium vor der Inokulation zugesetzt wurde. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen von drei Replikaten an.

Abbildung S9: Anfangswachstum von (A) Wildtyp P. putida ATCC 12633 oder (B) P. putida ATCC 12633 + pCLC ^F -low in Schüttelkolben mit 0–200 mM NaF in MSB mit 20 µg/mL Tc, 50 µg/mL Km und 20 mM ( RS )-Mandelsäure als einziger Kohlenstoffquelle.

Abbildung S10: Wachstum von P. putida ATCC12633 + pCLC ^F -low + pBBR1- P _T5 -DEF1 in normalem MSB (40 mM Phosphatpuffer) und in MSB mit erhöhter Phosphatpufferkonzentration (siehe Abbildung). Die Assays wurden in einer 96-Well-Platte mit 200 µl Medium, Antibiotika (Tc und Km) und 20 mM D-Milchsäure als einziger Kohlenstoffquelle durchgeführt. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen aus drei Replikaten an.

Tabelle S1: In dieser Studie verwendete Oligonukleotide (GROSSBUCHSTABEN = Annealing, KLEINBUCHSTABEN = komplementäre Sequenz für das Klonieren mittels Gibson-Assemblierung).

Tabelle S2: Genomsequenzierungs-Abdeckungsverhältnisse: Sequenzierungsabdeckung der CLC ^F -Plasmidsequenzen relativ zur Sequenzierungsabdeckung des Chromosoms.

Tabelle S3: Mutationen in den Genomsequenzen der an das Wachstum in LB + 425 mM NaF adaptierten Stämme PCLC ^F -low oder pCLC ^F -high. Als Referenz dienten die Sequenzen der nicht adaptierten Stämme und das Genom von P. putida ATCC 12633 aus GenBank (NCBI RefSeq-Assembly GCF_024508115). Chromosomale Mutationen wurden mit BreSeq v0.35.0 identifiziert. Mutationen in den Plasmiden wurden durch BLAST-Alignments der aufgelösten Plasmid-Contigs in den Genomsequenzen mit den Sequenzen von aus den nicht adaptierten Stämmen isolierten Plasmiden identifiziert.