Auswirkungen von Fluorid auf die antioxidative Aktivität und die mitochondriale Homöostase in der fetalen Rattenniere.

Abstract

Volltextstudie online unter
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0300483X25003014?via%3Dihub

Fluoridbelastung schädigt die menschliche Gesundheit. Jüngste Forschungsarbeiten konzentrieren sich zudem auf den Einfluss einer ungünstigen intrauterinen Umgebung auf die Entwicklung chronischer Nierenerkrankungen bei erwachsenen Nachkommen. Eine frühere Studie beschrieb, dass Fluorid die Nierenentwicklung verändert, Oligonephronie induziert und die vorzeitige Reifung von Restnephronen fördert. Daher ist es unerlässlich, die potenziellen Mechanismen fluoridinduzierter Veränderungen weiter zu erforschen. Weiblichen Wistar-Ratten wurden 20 Tage vor und nach der Paarung zwei Fluoriddosen (2.5 oder 5.0 mg/kg Körpergewicht/Tag) verabreicht. Die Ergebnisse zeigten, dass Fluorid die Aktivitäten von Katalase und Superoxiddismutase verringerte, während es gleichzeitig die Marker für die Aktivierung des nukleären Faktors Erythroid 2-verwandten Faktors 2 (Nrf2), die mitochondriale Dynamik, die Autophagie und die Biogenese erhöhte. Morphometrische Analysen ergaben eine Zunahme der Mitochondriengröße und des Mitochondriengehalts. Obwohl die Konzentrationen von Bcl-2-assoziiertem X-Protein (Bax) und B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2) anstiegen, nahmen die Aktivität von Caspase-3 und die Immunnachweisbarkeit im TUNEL-Assay ab. Viele dieser Veränderungen wurden hauptsächlich bei der hohen Fluoriddosis beobachtet. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Fluorid den Redoxstatus und die mitochondriale Homöostase verändert und gleichzeitig die Apoptose verringert. Es ist wichtig zu beachten, dass die Apoptose unter normalen Bedingungen eine entscheidende Rolle für die korrekte Nierenentwicklung spielt und mit zunehmender Reifung der Strukturen abnimmt. Daher könnten diese Veränderungen insgesamt zu unerwünschten Auswirkungen auf das postnatale Leben führen.

Grafische Zusammenfassung

Abkürzungen

ARSeitenverhältnis; ATP, Adenosintriphosphat; Bax, Bcl-2-assoziiertes X-Protein; Bcl-2, B-Zell-Lymphom 2; CATKatalase; CTRL, Kontrolle; DRP1, Dynamin-verwandtes Protein 1; F_2.5,2.5 mg Fluorid/kg Körpergewicht; F_5.0,5.0 mg Fluorid/kg Körpergewicht; GD, Tag der Trächtigkeit; yGCS, Gamma-Glutamylcystein-Synthetase; GPxGlutathionperoxidase; GRx, Glutathionreduktase; GSH, Glutathion; GSS, Glutathionsynthetase; HO-1Hämoxygenase 1; LC3-I, Mikrotubuli-assoziiertes Protein 1, leichte Kette 3; LC3-II, LC3-Phosphatidylethanolamin-Konjugat; MDA, Malondialdehyd; MFN2, Mitofusin 2; mtDNA, Mitochondriale DNA; NADPHNicotinamidadenindinukleotidphosphat; NBT, Nitroblautetrazolium; NRF1, Nukleärer respiratorischer Faktor 1; NRF2, Nukleärer respiratorischer Faktor 2; Nrf2, Nukleärer Faktor Erythroid 2-verwandter Faktor 2; PNrf2, Phosphoryliertes Nrf2; P62, Ubiquitin-bindendes Protein p62; PGC-1a, Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor-Gamma-Coaktivator 1-alpha; PINK1, PTEN-induzierte putative Kinase 1; PPINK1, Phosphoryliertes PINK1; PTE, Phosphatase- und Tensinhomolog; RFUs, Relative Fluoreszenzeinheit; ROS, Reaktive Sauerstoffspezies; S40, Serin 40; SEMStandardfehler des Mittelwerts; SOD, Superoxiddismutase; TFAM, Mitochondrialer Transkriptionsfaktor A; TUNNELTerminale Desoxynukleotidyltransferase TdT-vermittelte Nick-End-Markierung; VDACSpannungsabhängiger Anionenkanal.

Stichwörter

Fluorid
Niere
Mitochondriale
Apoptosis
Oxidativer Stress
Autophagie

1. Einleitung

Fluorid ist ein anorganisches Anion, das weltweit weit verbreitet ist (Kimambo et al., 2019Menschen können Fluorid aus verschiedenen Quellen aufnehmen, darunter anthropogene Aktivitäten, fluoridhaltige Zahnpflegeprodukte und die Fluoridierung des Trinkwassers (Johnston und Strobel, 2020Die Auswirkungen von Fluorid auf die menschliche Gesundheit können jedoch variieren und sowohl positive als auch negative Effekte hervorrufen, abhängig von seiner Konzentration und der über die Zeit aufgenommenen Menge (Ahmad et al., 2022).

Die schädlichen Auswirkungen von Fluorid betreffen harte und weiche Gewebe, einschließlich Leber, Lunge, Herz, Gehirn, Fortpflanzungsorgane und Nieren (Hamza et al., 2015, Sharma et al., 2023Die Mechanismen, die der Fluorid-induzierten Toxizität zugrunde liegen, beinhalten oxidativen Stress (Zuo ua, 2018), mitochondriale Dysfunktion (Zhao et al., 2020), und ein Ungleichgewicht in der Autophagie (Tian et al., 2020, Zhou et al., 2019).

Was die Nieren betrifft, so gibt es zwar widersprüchliche Informationen über die Auswirkungen von Fluorid auf Erwachsene, Jugendliche und Kinder (Jiménez-Córdova et al., 2019, Jiménez-Córdova et al., 2018), seine Auswirkungen während des letzten Schwangerschaftsstadiums (Montañez-Rodriguez et al., 2024) und im frühen Lebensalter (Niu et al., 2016) bleibt begrenzt. Zuvor hatte unsere Forschungsgruppe festgestellt, dass die Fluoridexposition während der Schwangerschaft die normale Nierenentwicklung stört und die Reifung der Tubulussegmente beschleunigt (Montañez-Rodriguez et al., 2024).

Die Reifung der antioxidativen Kapazität in den Nieren ist ein entscheidender Faktor im späten Stadium der Schwangerschaft. Sprague-Dawley-Rattenföten zeigen vom 18. Schwangerschaftstag (GD18) bis zum 22. Schwangerschaftstag (GD22) einen signifikanten Anstieg der Superoxiddismutase 1 und 2 (SOD1 bzw. SOD2), der Glutathionperoxidase (GPx) und der Katalase (CAT).Hayashibe et al., 1990Diese Anpassungen scheinen mit den Veränderungen im Stoffwechselbedarf des Nephrons übereinzustimmen (Diniz et al., 2023, Pejznochova et al., 2010), wobei die Nephrone am GD13.5 hohe Glykolyseraten und niedrige oxidative Phosphorylierungswerte aufweisen; dieses Profil ändert sich jedoch zwischen dem Ende der späten Schwangerschaft und dem Beginn der postnatalen Phase (Liu et al., 2017Im späten Stadium der Schwangerschaft durchlaufen die Mitochondrien signifikante Veränderungen, darunter einen Anstieg des mitochondrialen DNA-Gehalts (mtDNA), des Sauerstoffverbrauchs sowie des Gehalts und der Aktivität der Adenosintriphosphat-Synthase (ATP-Synthase) und des Cytochroms. c Oxidase, was auf eine Zunahme der Anzahl der Mitochondrien hinweist (Prieur et al., 1998, Prieur et al., 1995Dennoch ist eine Steigerung der ATP-Produktion durch die Mitochondrien auch indirekt mit einem Anstieg der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) verbunden (Robert Murphy, 2009).

Kurz gesagt, können Mitochondrien durch Fusions- und Fissionszyklen ihre Form verändern, ohne dass sich ihre Gesamtmasse ändert (Eisner et al., 2018Die Fission hilft dabei, beschädigte Mitochondrien zum Abbau abzusondern. Sie wird hauptsächlich durch das Dynamin-verwandte Protein 1 (DRP1) reguliert.Tang et al., 2021Umgekehrt ermöglicht die Fusion den Austausch von Proteinen, Metaboliten und Substraten und gewährleistet so die optimale Funktion des mitochondrialen Netzwerks. Sie wird unter anderem durch Mitofusine vermittelt (Bhargava und Schnellmann, 2017).

Andererseits kann die Reaktion auf Stressoren auch Veränderungen der mitochondrialen Masse durch Biogenese und/oder Mitophagie beinhalten (Eisner et al., 2018Kurz gesagt, ist der mitochondriale Transkriptionsfaktor A (TFAM) an der Initiierung der mtDNA-Transkription und der Replikation des mtDNA-Genoms beteiligt (Rubalcava-Gracia et al., 2023TFAM wird durch die nukleären respiratorischen Faktoren 1 und 2 (NRF1 bzw. NRF2) reguliert, die durch den Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptor-Gamma-Coaktivator 1-alpha (PGC-1) beeinflusst werden.a) (Ploumi et al., 2017).

Mitophagie ermöglicht den selektiven Abbau beschädigter Mitochondrien durch die Autophagie-Maschinerie (Doke und Susztak, 2022Die Phosphatase und der Tensinhomolog (PTEN)-induzierte putative Kinase 1 (PINK1) und Parkin sind die Hauptproteine, die am Ubiquitin-abhängigen Mitophagie-Signalweg beteiligt sind (Cho und Sun, 2020Darüber hinaus hängt die Aktivierung der Mitophagie vom Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials ab (Xian und Liou, 2021).

Wie bereits erwähnt, verändert Fluorid den Redoxstatus und die mitochondriale Homöostase nach der Geburt. Daher führten wir eine Studie mit weiblichen Wistar-Ratten durch, die umweltrelevanten Fluoridkonzentrationen ausgesetzt waren. Hauptziel dieser Studie war die Untersuchung des Einflusses von Fluorid auf den Redoxstatus und die Prozesse der mitochondrialen Homöostase. Zusätzlich untersuchten wir, ob diese Veränderungen die Apoptoseinduktion in der fetalen Niere beeinflussen.

2. Material und Methoden

2.1. Chemikalien

Alle Details zu den in dieser Studie verwendeten Chemikalien und Antikörpern sind in der Ergänzungsmaterial.

2.2. Experimentelles Design

Das Versuchsprotokoll wurde von der Ethikkommission für Tierversuche des CINVESTAV (Protokoll-Nr. 0041–13) geprüft und genehmigt und entsprach der mexikanischen Norm NOM-062-ZOO-1999. Darüber hinaus wurden alle Tierversuche unter strikter Einhaltung der ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Weibliche Wistar-Ratten (200–250 g) wurden in Polycarbonatkäfigen gehalten. Die Tiere hatten während der gesamten Studie freien Zugang zu Wasser und Futter. Nach einer einwöchigen Eingewöhnungsphase wurden die Ratten zufällig drei Gruppen zugeteilt (n = 8/Gruppe): (i) Kontrollgruppe (CTRL); (ii) F_2.5 und (iii) F_5.0 Gruppe, Tiere, die durch orale Gabe von Fluorid (2.5 oder 5.0 F) behandelt wurden^-Die Tiere erhielten täglich über 20 Tage eine Dosis von jeweils 1 kg Körpergewicht pro Tag. Gleichzeitig wurde ihr Östruszyklus überwacht. Am 20. Tag wurden Ratten im Proöstrus mit fertilen Männchen verpaart, um eine Trächtigkeit herbeizuführen. Am darauffolgenden Tag wurde die Befruchtung durch den Nachweis von Spermien im Vaginalabstrich bestätigt. Sobald die Befruchtung bestätigt war, wurde dieser Tag als Trächtigkeitstag 0 (GD0) definiert. Die Ratten wurden weitere 19 Tage behandelt. Am GD20 wurden die Tiere mit Ketamin/Xylazin (80 bzw. 8 mg/kg) narkotisiert, und die Föten wurden per Kaiserschnitt entnommen.Abb.. 1Unmittelbar wurden fetale Nieren entnommen. Eine Niere wurde für die elektronenmikroskopische Analyse in eine Fixierlösung eingelegt. Die übrigen Nieren des Wurfes wurden bis zur Homogenisierung bei -70 °C gelagert.

Die Dosierung und Expositionsdauer vor der Paarung wurden auf Grundlage einer früheren Studie unserer Forschungsgruppe bestimmt (Cárdenas-González et al., 2013).

2.3. Antioxidative Aktivität

Für die Gesamtproteinextraktion wurden fünf fetale Nieren pro Wurf benötigt. Das Gewebe wurde in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) mit 0.05 % Triton X-100 homogenisiert und sofort bei 10,000 g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen. Der Gesamtproteingehalt im Überstand wurde unmittelbar nach der Lowry-Methode bestimmt. Die CAT-Aktivität wurde durch Messung des Abbaus von 30 µg/l bestimmt.₂O₂ bei 240 nm (Aebi, 1984Die Aktivität der Glutathionreduktase (GRx) wurde durch die Auswertung des Verschwindens von Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH) bei 340 nm in Verbindung mit der Reduktion von Glutathiondisulfid zu Glutathion (GSH) bestimmt.Carlberg und Mannervik, 1975Die Oxidation von 1 µmol NADPH/min wurde als eine Einheit der GRx-Aktivität verwendet. Die GPx-Aktivität wurde bei 340 nm unter Verwendung von GRx und NADPH in einer gekoppelten Reaktion mit H₂ gemessen.₂O₂ Zersetzung (Lawrence und Burk, 1976Die Oxidation von 1 µmol NADPH/min wurde für beide Assays als eine Einheit Enzymaktivität verwendet. Die Gesamt-SOD-Aktivität wurde bei 560 nM unter Verwendung des Xanthin/Xanthinoxidase-Systems als Generator von Superoxidanionenradikalen und Nitroblautetrazolium (NBT) als Indikatorreagenz bestimmt.Weydert und Cullen, 2010Die Proteinmenge, die die NBT-Reduktion auf 50 % hemmte, wurde als eine Einheit SOD-Aktivität definiert. Die SOD2-Aktivität wurde mit derselben Methode bestimmt; allerdings wurde sie durch Zugabe von 2 mM Kaliumcyanid differenziert, welches SOD1 explizit hemmt. Alle Daten wurden als Einheiten pro Milligramm Protein (U/mg Protein) angegeben, mit Ausnahme von CAT, das als … angegeben wurde. k/mg Protein.

2.4. Antioxidativer Status

Die Malondialdehyd-Konzentrationen (MDA) wurden gemäß der von [Name des Autors] beschriebenen Methode bestimmt. Gérard-Monnier et al. (1998)Kurz gesagt, wurden mindestens sechs fetale Nieren pro Wurf in Phosphatpuffer (50 mM, pH 7.0), ergänzt mit 5 mM Butylhydroxytoluol, homogenisiert. Die Proben wurden 10 min bei 4 °C und 3000 g zentrifugiert. 100 µl Überstand wurden zu 650 µl einer Lösung von 15.4 mM 1-Methyl-2-phenylindol in einem Acetonitril/Methanol-Gemisch (3:1) gegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 150 µl konzentrierter Salzsäure gestartet. Die Absorption bei 586 nm wurde nach 40-minütiger Inkubation der Reaktionsmischung bei 45 °C gemessen.Gérard-Monnier et al., 1998Die Ergebnisse wurden mithilfe der Tetramethoxypropan-Standardkurve berechnet. Die MDA-Konzentrationen wurden in µmol/mg Protein angegeben.

2.5. Transmissionselektronenmikroskopie

Für die Transmissionselektronenmikroskopie wurde jeweils eine Niere pro Wurf mit Karnovskys Fixiermittel (einer Mischung aus 4 % Paraformaldehyd und 1.5 % Glutaraldehyd) in 0.2 M Sörensen-Puffer (pH 7.2) fixiert. Anschließend wurde das Gewebe mit 2 % Osmiumtetroxid nachfixiert, mit Ethanol entwässert und in Epoxidharz eingebettet. 70–90 nm dicke Schnitte wurden auf Kupferhalter aufgebracht, mit Uranylacetat und Bleicitrat-Reynol kontrastiert und mit einem Transmissionselektronenmikroskop (Tecnai Spirit BioTwin, FEI, Hillsboro, OR, USA) untersucht. Die Mitochondriengröße (µm) wurde bestimmt.²Das Aspektverhältnis (AR) und das Verhältnis von Mitochondrienfläche zu Feldfläche wurden mithilfe der von den National Institutes of Health (NIH; Bethesda, MD, USA) bereitgestellten ImageJ-Software bestimmt.

2.6. Westernblot

Für die Extraktion des Gesamtproteins wurden fünf fetale Nieren pro Wurf benötigt. Das Gewebe wurde in RIPA-Puffer, der Protease- und Phosphataseinhibitoren (1 mM NaF, 1 mM Na) enthielt, homogenisiert.₃VO₄Die Proben wurden 15 min bei 4 °C und 10,000 g zentrifugiert. Unmittelbar danach wurde die Proteinkonzentration im Überstand mittels Bradford-Assay bestimmt. Anschließend wurden 25 µg Protein pro Well in 10–17%ige Polyacrylamid-Gele aufgetragen und elektrophoretisch getrennt. Die Proteine wurden sofort auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit Ponceau-Rot angefärbt, um den Proteintransfer und die gleichmäßige Beladung der Proben zu überprüfen. Nicht-spezifische Bindungsstellen auf den Membranen wurden 1 h bei Raumtemperatur mit 5%iger Magermilch oder 5%iger Magermilch plus 2.5% BSA in Phosphatpufferlösung mit 0.1% Tween 20 blockiert. Die Membranen wurden über Nacht bei 4 °C mit einem spezifischen primären Antikörper inkubiert.Zusatztabelle 1).

Am nächsten Tag wurden die Membranen 2 h bei Raumtemperatur mit dem entsprechenden Sekundärantikörper inkubiert. Die Banden wurden mittels Chemilumineszenz (Immobilon Forte Western Meerrettichperoxidase-Substrat) auf Autoradiographiefilmen sichtbar gemacht. Die Quantifizierung der Banden erfolgte densitometrisch mit der Software ImageJ (Bethesda, MD, USA). Die Daten wurden mit den Daten von [Referenz einfügen] normalisiert. B-Aktin (1:3500).

2.7. DNA-Fragmentierung (TUNEL)

Die DNA-Fragmentierung in apoptotischen Zellen wurde mittels der TUNEL-Methode (Terminal-Deoxynucleotidyl-Transferase-vermittelte Nick-End-Markierung) nachgewiesen. Hierfür wurde jeweils eine Niere aus drei verschiedenen Würfen verwendet, um TUNEL-positive Zellen zu identifizieren. Von allen Nieren wurden Semidünnschnitte angefertigt. Die Gewebeschnitte wurden in Xylol entparaffiniert, rehydriert und mit Proteinase K (20 µg/ml) behandelt. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde durch Inkubation in 3 % H₂O blockiert.₂O₂Nach dem Abschrecken wurden die Schnitte mit Sniper Background inkubiert, um unspezifische Bindungen zu reduzieren. Anschließend wurden die Schnitte 1 h lang in einer feuchten Kammer bei 37 °C mit dem Enzym terminale Desoxynukleotidyltransferase inkubiert. Nach einem Waschschritt wurden die Schnitte 30 min lang bei Raumtemperatur mit Anti-Digoxigenin-Konjugat inkubiert. Abschließend wurden die Schnitte nach erneutem Waschen mit Peroxidase-Substrat entwickelt, gespült und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Untersuchung der Schnitte erfolgte schließlich mit einem Lichtmikroskop, das mit einer digitalen Nikon-Kamera ausgestattet war.

2.8. Caspase-3-Aktivität

Die Caspase-3-Aktivität wurde mithilfe des Caspase-3-Assay-Kits gemäß den Herstellerangaben bestimmt. Kurz gesagt, wurden 5–6 Nieren pro Wurf in Lysepuffer homogenisiert und die Proteinkonzentration nach der Bradford-Methode bestimmt. 150 µg Protein wurden in eine 96-Well-Platte pipettiert und 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Caspase-Aktivität wurde als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU)/µg Protein angegeben.

2.9. statistische Analyse

Alle Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben. Die Normalverteilung wurde mittels Kolmogorov-Smirnov-Test geprüft. Die Daten wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit anschließendem Dunnett-Post-hoc-Test unter Verwendung von GraphPad Prism 10 (GraphPad Software, Boston, MA, USA) analysiert. Ein p-Wert < 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

3. Ergebnisse

3.1. Fluorid verändert den Antioxidantienstatus

Um festzustellen, ob Fluoridexposition eine antioxidative Reaktion hervorruft, untersuchten wir die Aktivität mehrerer antioxidativer Enzyme. Zunächst blieb die GRx-Aktivität in allen Fluoridexpositionsgruppen konstant (Abb.. 2A) Bemerkenswerterweise zeigte die GPx-Aktivität nur in der F-Gruppe einen signifikanten Anstieg._5.0 Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb.. 2B). Darüber hinaus verringerte sich der CAT-Wert in beiden Fluorid-exponierten Gruppen (Abb.. 2C) und Gesamt-SOD (Abb.. 2D) Aktivitäten im Vergleich zur Kontrollgruppe. Im Gegensatz dazu blieb die SOD-2-Aktivität nach Fluoridexposition unverändert (Abb.. 2E) Die Überproduktion von ROS kann zu oxidativem Stress führen. Daher untersuchten wir, ob Fluoridexposition Lipidperoxidation induziert, indem wir MDA quantifizierten. Die MDA-Werte sanken jedoch in der F-Gruppe signifikant._2.5 Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb.. 2F). Da der Transkriptionsfaktor Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 (Nrf2) als Hauptregulator der antioxidativen Antwort gilt, haben wir sowohl die Konzentrationen von Nrf2 als auch seiner phosphorylierten Form (pNrf2) bestimmt.Abb.. 2G), und stellten fest, dass die Fluoridexposition die Nrf2-Werte nicht veränderte (Abb.. 2H). Umgekehrt wiesen beide Fluorid-exponierten Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe (CTRL) einen signifikant erhöhten pNrf2-Spiegel auf (Feigen. 2G und 2I) Durch die Bestimmung des pNrf2/Nrf2-Verhältnisses wurde festgestellt, dass dieser Signalweg nur durch die Behandlung mit F aktiviert wurde._2.5 (Abb.. 2J). Zusätzlich untersuchten wir die Konzentrationen von Gamma-Glutamylcystein-Synthetase (γGCS) und SOD2, die durch Nrf2 reguliert werden. Die Konzentrationen beider Proteine blieben in allen Gruppen unverändert (Abb.. 2K und L).

3.2. Fluorid verändert die mitochondriale Dynamik und verstärkt die Biogenese

Um festzustellen, ob die Fluoridexposition die mitochondriale Dynamik beeinflusst, untersuchten wir wichtige Marker der Fission und Fusion. Bezüglich der Fission erhöhten beide fluoridexponierten Gruppen die DRP1-Proteinwerte im Vergleich zur Kontrollgruppe (CTRL) signifikant.Abb.. 3A) Bezüglich der Fusion stiegen die Mitofusin-2-(MFN2)-Proteinwerte nur in der F-Gruppe an._5.0 Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb.. 3B).

Andererseits untersuchten wir auch den Einfluss von Fluorid auf die mitochondriale Biogenese und analysierten dazu Marker auf verschiedenen Ebenen des Signalwegs. Zunächst zeigte sich, dass die PGC-1-Proteinwerte nur in der F-Gruppe signifikant anstiegen._5.0 Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb.. 3C). In ähnlicher Weise zeigten beide Gruppen, die Fluorid ausgesetzt waren, einen Anstieg der NRF1-Werte (Abb.. 3D) Im Gegensatz zu früheren Studien an adulten Nieren von Wistar-Ratten deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass das TFAM-Signal in den fetalen Nieren bei etwa 50 kDa nachgewiesen wurde. Im Vergleich dazu fand sich kein Hinweis auf das Protein bei 28 kDa. Bemerkenswerterweise wurde eine signifikante Reduktion des TFAM-Proteinspiegels ausschließlich in den F-Embryonen beobachtet._5.0 Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb.. 3E). Schließlich zeigte der Spiegel des spannungsabhängigen Anionenkanalproteins (VDAC) als Marker für den Mitochondriengehalt einen signifikanten Anstieg in der F-Gruppe._5.0 Gruppe (Abb.. 3F).

3.3. Fluorid fördert die Aktivierung der Mitophagie

Neben Veränderungen in Struktur und Synthese können Mitochondrien auch durch einen Prozess namens Mitophagie abgebaut werden. Daher untersuchten wir Marker des autophagischen Flusses und der Mitophagie, um die potenziellen Auswirkungen von Fluorid zu analysieren. Die Konzentrationen von Beclin-1 (Abb.. 4A), pPINK1 (Abb.. 4C), LC3-I (Abb.. 4D) und LC3-II (Abb.. 4D und E) nahmen in der F signifikant zu._5.0 Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Darüber hinaus war der F_2.5 Die Gruppe zeigte auch einen deutlichen Anstieg der LC3-I-Werte. Andererseits hatte die Fluoridexposition keinen Einfluss auf die Konzentrationen des Ubiquitin-bindenden Proteins p62 (p62).Abb.. 4B) oder das LC3-II/LC3-I-Verhältnis (Abb.. 4F).

3.4. Fluorid verändert die mitochondriale Ultrastruktur

Die beobachteten Veränderungen der mitochondrialen Dynamik erforderten eine detaillierte Untersuchung der mitochondrialen Ultrastruktur in tubulären Epithelzellen mittels Elektronenmikroskopie. Die CTRL-Gruppe wies überwiegend ovale Mitochondrien auf, nur eine geringe Anzahl bohnenförmiger Mitochondrien war vorhanden. Darüber hinaus zeigten die Mitochondrien dieser Gruppe diffuse Cristae (Abb.. 5A). Im Gegensatz dazu wiesen die mit Fluorid behandelten Gruppen eine deutlich höhere Anzahl an Mitochondrien auf als die Kontrollgruppe (CTRL). Darüber hinaus zeigten diese Mitochondrien verschiedene morphologische Veränderungen, darunter sowohl bohnenförmige als auch längliche Formen. Außerdem sind die Cristae der Mitochondrien in beiden Gruppen detaillierter dargestellt (Abb.. 5B und C). Interessanterweise zeigten einige Bereiche innerhalb der fluoridexponierten Gruppen das Vorhandensein von ringförmigen Mitochondrien und Lysosomen (Ergänzende Abb. 1).

Andererseits ergab die morphometrische Analyse, dass die Mitochondriengröße (Abb.. 5D) und der AR-Parameter (Abb.. 5E) war in den fluoridexponierten Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht, was auf eine Verlängerung der Mitochondrien hindeutet. Die Fluoridexposition erhöhte auch das Verhältnis von Mitochondrienfläche zu Feldfläche (Abb.. 5F), was auf einen erhöhten Mitochondriengehalt hindeutet.

3.5. Fluorid verändert die Induktion der Apoptose

Das Ungleichgewicht der mitochondrialen Homöostase kann zum Zelltod führen. Angesichts des engen Zusammenhangs zwischen mitochondrialen Veränderungen und dem mitochondrialen Apoptoseweg haben wir zunächst die Konzentrationen pro-apoptotischer und anti-apoptotischer Faktoren untersucht (Abb.. 6A) Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass in beiden Gruppen, die Fluorid ausgesetzt waren, die Konzentrationen des Bcl-2-assoziierten X-Proteins (Bax) signifikant anstiegen (Abb.. 6B). Im Gegensatz dazu stiegen die B-Zell-Lymphom-(Bcl-2)-Spiegel nur in der F-Gruppe an._5.0 Gruppe (Abb.. 6C). Darüber hinaus zeigte das Bax/Bcl-2-Verhältnis ausschließlich in der F-Gruppe einen signifikanten Anstieg._2.5 Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb.. 6D).

Um zu klären, ob Veränderungen von Bax und Bcl-2 die Apoptoseinduktion beeinflussen, führten wir eine TUNEL-Färbung durch und beurteilten die Caspase-3-Aktivität. Mikroskopische Aufnahmen zeigten eine hohe Anzahl TUNEL-positiver Zellen in der Kontrollgruppe (CTRL) im Vergleich zu den mit Fluorid exponierten Zellen (Abb.. 6E). Dieses Signal wurde vorwiegend am Rand der Niere beobachtet. Entsprechend diesen Befunden nahm die Caspase-3-Aktivität in den mit Fluorid behandelten Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe (CTRL) ab (Abb.. 6F). Zusammengenommen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Fluorid die Induktion von Apoptose in den Nieren während der Schwangerschaft verringert.

4. Diskussion

Bisher ist bekannt, dass eine Fluoridbelastung während der Schwangerschaft einen negativen Einfluss auf die Nierenentwicklung hat. Da oxidativer Stress, mitochondriale Dysfunktion und Apoptose in anderen Modellen zur Beeinträchtigung der Nierenentwicklung beitragen (Ho et al., 2023, Stewart et al., 2019Wir untersuchten diese potenziellen Mechanismen bei fluoridbedingten Nierenveränderungen während der Schwangerschaft.

Im Gegensatz zu dem, was im postnatalen Leben geschieht, wo beschrieben wurde, dass die Fluoridexposition die Aktivität von CAT, GPx, SOD und GRx, den GSH-Spiegel und die Nrf2-Aktivierung verringert (Owumi et al., 2024, Sharma et al., 2023Die Reaktion während der Schwangerschaft war teilweise anders. Erstens basierte dies auf der Häufigkeit der SOD-Isoformen in diesem Stadium (Hayashibe et al., 1990sowie die negativen Auswirkungen von Fluorid auf die SOD1-mRNA-Expression und ihre Cofaktoren (Cu, Zn) (Bouaziz et al., 2007, Luo et al., 2017Daraus lässt sich schließen, dass SOD1 während der Schwangerschaft möglicherweise empfindlicher auf Fluoridbelastung reagiert als SOD2. Was die Aktivitäten von GPx und CAT betrifft, so arbeiten diese Enzyme zusammen (Lushchak, 2012), was die Veränderungen der GPx-Aktivität als Reaktion auf den Rückgang der CAT-Aktivität erklären könnte. Die Tatsache, dass Fluorid die GRx-Aktivität nicht veränderte, könnte hingegen mit seiner Aktivität am Ende der Schwangerschaft zusammenhängen, die die im Erwachsenenalter beobachtete deutlich übersteigt (Vlessis und Mela-Riker, 1989).

Insgesamt können diese Veränderungen die Fähigkeit zur Neutralisierung der ROS-Produktion beeinträchtigen. Folglich kann dies Zellschäden wie die Lipidperoxidation begünstigen. Unerwarteterweise sanken die MDA-Werte in der F-Gruppe._2.5 Gruppe, möglicherweise aufgrund einer offensichtlichen Nrf2-Aktivierung. Obwohl wir die Aktivierung nicht durch Quantifizierung der Nrf2-Nuklearspiegel bestätigt haben, ist bekannt, dass die Nrf2-Nukleartranslokation die Phosphorylierung von S40 erfordert (Huang et al., 2002), was in unserer Forschung positiv identifiziert wurde. Darüber hinaus verwerfen wir aufgrund der Ergebnisse zu den yGCS-Werten, einem Nrf2-Zielmolekül, die Annahme, dass MDA-Veränderungen mit der GSH-Neusynthese zusammenhängen. Umgekehrt kann die mögliche Beteiligung des Nrf2/Hämoxygenase-1 (HO-1)/Ferritin-Signalwegs nicht ausgeschlossen werden, da HO-1 zur Aufrechterhaltung der intrazellulären Homöostase beiträgt, indem es die Ferritin-Expression fördert (Kajarabille und Latunde-Dada, 2019), wodurch freies Fe² begrenzt wird.⁺ Verfügbarkeit und Verhinderung der Bildung von Hydroxylradikalen und der daraus resultierenden MDA-Produktion.

Neben der Toxizität reguliert ROS auch Transkriptionsfaktoren, die an Proliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose beteiligt sind (Spinelli und Haigis, 2018Daher können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass ein durch Fluorid hervorgerufenes Ungleichgewicht des Redoxstatus an den Veränderungen in der Nierenentwicklung beteiligt sein könnte.

Hinsichtlich der mitochondrialen Dynamik stützen sowohl morphometrische Veränderungen als auch Modifikationen in MFN2 und DRP1 teilweise den Vorschlag von Meyer et al., wonach die Exposition gegenüber niedrigen bis moderaten Stressoren die mitochondriale Fusion und Fission verstärkt, was zu einer stärkeren Vernetzung der Mitochondrien und einem erhöhten Umsatz beschädigter Komponenten führt.Meyer et al., 2017).

Ähnlich zeigen neuere Forschungsergebnisse, dass die Steigerung der Zellspaltung die schädlichen Auswirkungen von Fluorid abmildert, indem sie die Mitophagie erhöht und die Apoptose hemmt (Zhao et al., 2019Diese Fragmentierung ist entscheidend für die Einleitung der Mitophagie, da Autophagosomen keine mitochondrialen Fragmente aufnehmen können, die länger als eine bestimmte Größe sind (Cho und Sun, 2020Darüber hinaus entdeckten wir auch ringförmige Mitochondrien, die ihnen helfen, der Mitophagie zu widerstehen, und die sogar ihre ursprüngliche Form wiedererlangen können, wenn der metabolische Stress verschwindet (Liu und Hajnóczky, 2011, Zhou et al., 2020).

Autophagie gilt als adaptiver Mechanismus, der Zellen vor verschiedenen Stressfaktoren schützt. Überschreitet der Stresspegel jedoch einen kritischen Schwellenwert, kann dies die Aktivierung der Apoptose auslösen.Kroemer et al., 2010Die Überwachung des autophagischen Flusses erfordert die Beurteilung von Proteinen in verschiedenen Stadien, darunter Beclin-1 (das die Autophagosomenbildung einleitet), LC3-II (das die Verlängerung und den Verschluss des Autophagosoms erleichtert) und p62 (ein Polyubiquitin-bindendes Protein, das sich in das Autophagosom integriert) (Tian et al., 2020Unsere Ergebnisse zeigten, dass alle Autophagie-Flux-Marker mit Ausnahme von p62 anstiegen. Diese Reaktion stimmt mit Beobachtungen in den Nieren von ICR-Mäusewelpen überein, die vor und während der Trächtigkeit Fluorid im Trinkwasser ausgesetzt waren, und unterstützt die Aktivierung der Autophagie (Guo et al., 2020Umgekehrt ergab eine andere Studie, dass die Fluoridexposition von der Schwangerschaft bis zur Pubertät zu einer Hemmung der Autophagie führt (Tian et al., 2020). Obwohl die p62-Werte nach Fluoridexposition unverändert blieben, könnten auch andere Autophagie-Adapter beteiligt sein (Zellner et al., 2021Tatsächlich könnte p62 aufgrund der Nrf2-Aktivierung unverändert bleiben, da im p62-Promotor antioxidative Responselementsequenzen vorhanden sind, wodurch eine positive Rückkopplung ermöglicht wird (Silva-Islas und Maldonado, 2018Letztendlich gewährleisten die Veränderungen in pPINK1 den selektiven Abbau von Mitochondrien und verhindern dadurch Zellschäden (Palikaras et al., 2018).

Neben ihren schützenden oder schädlichen Funktionen spielt die Autophagie auch eine Rolle bei der Differenzierung zellulärer Strukturen. Konkret zeigte eine Studie an C57BL/6-Mäusen eine Korrelation zwischen dem Grad der Podocyten-Differenzierung und der Expression von Autophagie-Markern, während die Hemmung der Autophagie einen negativen Einfluss hatte (Zhang et al. 2017Daher könnte die Aktivierung der Autophagie wertvolle Erkenntnisse darüber liefern, wie Fluoridexposition die Podocytenreifung fördert.

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fluoridexposition die mitochondriale Biogenese trotz verminderter TFAM-Werte fördert. TFAM wurde in der fetalen Niere als Dimer nachgewiesen. Die TFAM-Dimerisierung ist für die Kompaktierung der mtDNA zu Nukleoiden notwendig.Ngo et al., 2014Unabhängig davon, ob TFAM als Monomer oder Dimer vorliegt, können bereits kleine Veränderungen des TFAM-Spiegels die für Replikation und Transkription verfügbare DNA erheblich beeinflussen (Farge et al., 2014Daher vermuten wir, dass eine Verringerung der TFAM-Dimerisierung zu einer Entspannung der mtDNA führt und somit deren Transkription erleichtert.

Bcl-2 und Bax sind etablierte Proteine, die eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Apoptose spielen (Doke und Susztak, 2022Obwohl der Anstieg der Bax-Werte mit anderen Berichten übereinstimmt, steht unser Befund bezüglich der Bcl-2-Werte im Widerspruch zu einem Großteil der bestehenden Literatur (Song et al., 2017Diese Diskrepanzen lassen sich möglicherweise darauf zurückführen, dass sich diese Nieren noch in der Entwicklung befinden. In diesem Zusammenhang wird Bcl-2 während der Entwicklung in verschiedenen Geweben exprimiert, unter anderem in der Niere, wo es in Bereichen nachgewiesen wird, die durch induktive Wechselwirkungen zwischen epithelialen und mesenchymalen Strukturen gekennzeichnet sind (LeBrun et al., 1993In diesem Zusammenhang zeigte eine Studie an Mausfeten, dass Bax und Bcl-2 in reifen Nierenstrukturen stark exprimiert werden, während ihre Expression in unreifen proximalen und distalen Tubuli schwach ist, was die Annahme stützt, dass Bax und Bcl-2 eine Rolle bei der Nierenmorphogenese spielen (Song et al., 2012Umgekehrt hat der Verlust von Bcl-2 dramatische Auswirkungen auf die Nierenentwicklung und behindert die Differenzierung und Reifung (Sorenson, 2004Interessanterweise fallen die Veränderungen von Bax und Bcl-2 während der Nierenentwicklung auch mit Veränderungen in der Expression von Cytochrom c zusammen, wodurch ein Zusammenhang zwischen ihnen hergestellt wird (Song et al., 2017aDennoch ist unbekannt, ob dieser Zusammenhang mit dem Energiebedarf oder der ROS-Produktion als Signalweg zusammenhängt.

Schließlich ist es neben der Auslösung von Apoptose durch Fluoridexposition wichtig hervorzuheben, dass die Apoptose selbst während der Entwicklung eine entscheidende Rolle bei der Etablierung der Gewebearchitektur spielt (Woolf und Welham, 2002So erleichtert es die Umwandlung sich entwickelnder Strukturen in ihre ausgereiften Formen und entfernt überschüssige Zellen, wodurch eine optimale Gewebefunktionalität gewährleistet wird (Carev et al., 2006In diesem Zusammenhang haben Tiermodelle gezeigt, dass sowohl die Caspase-Aktivierung als auch die TUNEL-Färbung gegen Ende der Schwangerschaft zunehmen und in der postnatalen Phase abnehmen (Song et al., 2017aIm Gegensatz dazu nahmen beide Marker, die mit der Apoptoseinduktion in Zusammenhang stehen, mit der Fluoridexposition ab, was kontraproduktiv sein kann, da die Hemmung oder Inaktivierung von Caspase-3 die Nierenentwicklung beeinträchtigen und zu einer verminderten Nephronbildung führen kann (Hayashi und Araki, 2002).

Unsere bisherigen Ergebnisse deuten möglicherweise auf eine Veränderung des Stoffwechselprofils hin, die bekanntermaßen zu Entwicklungsstörungen und sogar Nierenerkrankungen beiträgt (Cargill und Sims-Lucas, 2020Darüber hinaus kann die Hemmung der Glykolyse die Nephrogenese fördern und zu einer vorzeitigen Nephrondifferenzierung führen (Diniz et al., 2023, Liu et al., 2017Darüber hinaus hat die Forschung mit Organoiden gezeigt, dass die Exposition gegenüber anderen Umweltgiften, wie beispielsweise Mikroplastik, ebenfalls Stoffwechselveränderungen mit sich bringt, wobei die Glykolyse reduziert und gleichzeitig die Aktivität im Tricarbonsäurezyklus erhöht wird, was sich wiederum auf die Entwicklung auswirkt (Zhou et al., 2025).

Im Hinblick auf die Einschränkungen unserer Studie wäre die Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik, einschließlich Sauerstoffverbrauch, ATPase-Aktivität, ATP-Produktion und Membranpotenzial, ideal gewesen; die begrenzte Probenverfügbarkeit für die Mitochondrienisolierung machte dies jedoch unmöglich. Trotz dieser Einschränkungen liefert die Analyse der mitochondrialen Morphologie und der Konzentrationen verschiedener mitochondrialer Biomarker wertvolle Einblicke in die mitochondriale Bioenergetik, da diese Komponenten eng miteinander verknüpft sind.

5. Fazit

Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Fluoridexposition den Redoxstatus und die mitochondriale Homöostase verändert. Gleichzeitig verringerte sie die Apoptoseinduktion (Abb.. 7Diese Veränderungen könnten mit der frühzeitigen Nierenreifung zusammenhängen, wie unsere Forschungsgruppe bereits beschrieben hat. Unsere Ergebnisse könnten Kontroversen hinsichtlich der Sicherheit einer Fluoridexposition während der Schwangerschaft auslösen; daher sind weitere detaillierte Studien zu den Auswirkungen von Fluorid in diesem speziellen Kontext unerlässlich.

Abb.. 7

Abb.. 7Integratives Schema. Mehrere Parameter in der fetalen Niere wurden nach Fluoridexposition beeinflusst: (1) Die Aktivitäten der Superoxiddismutase 1 (SOD1) und der Katalase (CAT) nahmen ab, während die der Glutathionperoxidase (GPx) zunahm. Zusätzlich (2) blieben die Gesamtspiegel des nukleären Faktors Erythroid 2-verwandten Faktors 2 (Nrf2) unverändert; seine phosphorylierte Form (pNrf2) war jedoch signifikant erhöht. Bezüglich der mitochondrialen Dynamik zeigte (3) Mitofusin 2 einen leichten Anstieg, während (4) die Spiegel des Dynamin-verwandten Proteins 1 (DRP1) deutlich erhöht waren. Andererseits (5) nahmen Proteine, die an der Biogenese beteiligt sind, wie der Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptor-Gamma-Coaktivator 1-alpha (PGC-1α) und der nukleäre respiratorische Faktor 1 (NRF1), nach Fluoridexposition zu; Gleichzeitig nahm das Dimer des mitochondrialen Transkriptionsfaktors A (TFAM) ab, was wahrscheinlich zu einer verminderten Kompaktierung der mitochondrialen DNA führte. Ebenso zeigten (6) Proteine, die mit der Mitophagie assoziiert sind, darunter Beclin-1 (BCN1), die leichte Kette 3 des mikrotubulusassoziierten Proteins 1 (LC3) und die phosphorylierte PTEN-induzierte putative Kinase 1 (pPINK1), erhöhte Werte. Letztendlich beeinflussen mitochondriale Veränderungen die Apoptose; so stiegen (7) die Bax-Werte signifikant an, während die Bcl-2-Werte nur leicht erhöht waren. Trotz der Veränderungen des Bax-Spiegels war die Caspase-3-Aktivität in den mit Fluorid exponierten fetalen Nieren verringert.

CRediT-Autorenbeitragserklärung

Esaú Montañez-Rodriguez: Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, Methodik, Untersuchung. Olivier Christophe Barbier: Schreiben – Überprüfung & Bearbeitung, Betreuung, Ressourcen, Projektverwaltung, Finanzierung, Konzeptentwicklung. Sabino Hazael Avila-Rojas: Schreiben – Originalentwurf, Visualisierung, Methodik, Untersuchung, Formale Analyse, Datenaufbereitung, Konzeptualisierung. José Pedraza-Chaverri: Schreiben – Überarbeitung & Redaktion, Ressourcen, Methodik. Casimiro Gerarduzzi: Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. Ana Karen Pantaleón-Gómez: Schreiben – Überarbeitung & Redaktion, Visualisierung, Methodik, Recherche. Iliana Angélica Tostado-Fernández: Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, Methodik. Juan Carlos León-Contreras: Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, Methodik, Untersuchung. Rogelio Hernández-Pando: Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, Methodik, Untersuchung. Omar Noel Medina-Campos: Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, Methodik. Brenda Marquina-Castillo: Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, Methodik.

Förderung

SHAR ist dankbar für das Postdoktorandenstipendium von CONAHCyT (CVU: 487583Diese Arbeit wurde teilweise durch PAPIIT (DGAPA, UNAM) IN202725 und Bundesmittel von Cinvestav (Presupuesto Federal) unterstützt.

Interessenerklärung

Die Autoren erklären folgende finanzielle Interessen/persönliche Beziehungen, die als potenzielle Interessenkonflikte gelten könnten: Sabino Hazael Avila Rojas gibt an, finanzielle Unterstützung von Conahcyt erhalten zu haben. Jose Pedrazza Chaverri gibt an, finanzielle Unterstützung von der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko erhalten zu haben. Alle weiteren Autoren erklären, dass keine ihnen bekannten finanziellen oder persönlichen Interessenkonflikte bestehen, die die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse beeinflusst haben könnten.

Anerkennungen

Wir bedanken uns herzlich für die technische Unterstützung von MVZ Rafael Muñoz Leyva, Rene Panfilo Morales und Maria Antonieta Lopez Lopez bei der Tierpflege.

Anhang A. Ergänzungsmaterial

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Ergänzungsmaterial

Datenverfügbarkeit

Daten werden auf Anfrage zur Verfügung gestellt.

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