Einfluss der Probenmasse auf die Zuverlässigkeit der Fluoridbestimmung in Zehennägeln zur Expositionsbewertung.

Zehennägel werden aufgrund ihrer praktischen Vorteile, wie z. B. der einfacheren Entnahme und Lagerung, häufig als nicht-invasive Biomarker in der epidemiologischen Forschung eingesetzt. Im Vergleich zu Fingernägeln sind sie generell weniger anfällig für äußere Verunreinigungen [ 1 , 2 ] und wachsen langsamer, wodurch sie sich gut zur Beurteilung der Langzeitexposition gegenüber Umwelt- und chemischen Substanzen wie Spurenelementen und Nichtmetallen [ 2 ], einschließlich Fluorid [ 1 ], eignen.

Fluorid, das negativ geladene Ion des Elements Fluor, ist in der Natur und in der menschlichen Ernährung weit verbreitet. Aufgrund seiner nachgewiesenen Rolle bei der Kariesprävention [ 3 ] wird Fluorid häufig Zahnpasta und Mundspülungen zugesetzt und in der klinischen Praxis topisch angewendet. In einigen Regionen wird es im Rahmen von Maßnahmen des öffentlichen Gesundheitswesens auch Trinkwasser, Salz und Milch beigemischt [ 4 ]. Eine übermäßige Fluoridaufnahme ist jedoch mit negativen Auswirkungen auf mineralisierte und nicht-mineralisierte Gewebe [ 5 , 6 , 7 ] sowie mit potenziellen gesundheitlichen Beeinträchtigungen verbunden, darunter eine verminderte Intelligenz bei Kindern [ 8 , 9 ] und Störungen der Schilddrüsenfunktion [ 10 ]. Diese Bedenken unterstreichen die wachsende Notwendigkeit, die Fluoridbelastung in verschiedenen Bevölkerungsgruppen besser zu verstehen und zu überwachen.

Nach der oralen Aufnahme wird Fluorid hauptsächlich im Magen und Dünndarm resorbiert. Dieser Prozess wird von Faktoren wie dem pH-Wert im Magen-Darm-Trakt, Wechselwirkungen mit Nährstoffen und der Zusammensetzung der gesamten Nahrung beeinflusst [ 11 ]. Nach der Resorption verteilt sich Fluorid über den Blutkreislauf, wobei die Plasmakonzentrationen von Faktoren wie dem Knochenstoffwechsel, der Nierenfunktion und dem Säure-Basen-Haushalt des Körpers abhängen [ 12 ]. Aufgrund seiner hohen Affinität zu mineralisiertem Gewebe lagert sich Fluorid vorwiegend in Hartgeweben (hauptsächlich Knochen) ab, wo es stark – wenn auch nicht irreversibel – gebunden wird. Im Gegensatz dazu werden nur etwa 1 % in Weichgeweben eingelagert. Zirkulierendes Fluorid wird auch in die Nagelmatrix eingebaut, und sein Gehalt in den Nägeln hängt von Faktoren ab, die das Nagelwachstum und die Nagellänge beeinflussen [ 13 ]. Der Nachweis von Fluorid in Finger- und Zehennägeln spiegelt die Exposition über einen Zeitraum von etwa 3–4 Monaten wider [ 13 , 14 ]. Dies hat die Verwendung von Nägeln als Biomarker für eine längerfristige Exposition unterstützt, insbesondere im Zusammenhang mit dentaler Fluorose [ 15 , 16 ].

Im Vergleich zu anderen Biomarkern für Fluoridbelastung gelten Zehennägel als Biomarker für eine kürzlich erfolgte Exposition [ 17 ]. Während aktuelle Biomarker wie Blut/Plasma, Speichel und Urin kurzfristige Schwankungen erfassen, spiegeln sie unterschiedliche Expositionszeiträume wider: Blut/Plasma die Exposition der letzten 3–6 Stunden, Speichel die der letzten Stunden (da er den Plasmaspiegel widerspiegelt) und Urin die der vorangegangenen 24 Stunden [ 18 ]. Historische Biomarker wie Knochen und Zähne bieten ein längeres Zeitfenster, erfordern jedoch invasive Probenentnahmen [ 18 ]. Im Vergleich zu Haaren, die ebenfalls eine keratinisierte Matrix darstellen, sind Zehennägel weniger anfällig für äußere Verunreinigungen und zeigen stärkere, oft konsistentere Korrelationen mit der Fluoridaufnahme [ 19 ].

Für die Fluoridanalyse in Nägeln wurden verschiedene Techniken eingesetzt, darunter die Neutronenaktivierungsanalyse [ 20 , 21 ], Säureaufschluss-/Extraktionsverfahren [ 22 , 23 ], Gaschromatographie [ 24 ], kolorimetrische Spektrophotometrie [ 25 ] und die am häufigsten angewandte Methode, die Hexamethyldisiloxan (HMDS)-gestützte Diffusion [ 14 , 26 ]. Die potenziellen Auswirkungen von methodischen und protokollbedingten Unterschieden bei der Fluoridanalyse in der Nagelmatrix mittels HMDS-gestützter Diffusion erfordern jedoch weitere Forschung mit dem Ziel einer Standardisierung [ 27 ].

Die HMDS-gestützte Diffusionsmethode dient der Fluoridfreisetzung durch säureinduzierte Dissoziation von HMDS, einer Organosiliciumverbindung [ ₂₈ ] . In Gegenwart einer starken Säure wie Schwefelsäure (H₂SO₄ ) _reagiert HMDS mit dem aus der Probe oder dem Standard entstehenden Fluorwasserstoff (HF) und bildet die flüchtige Verbindung Trimethylfluorsilan. Diese diffundiert in eine alkalische Falle, wo das Fluoridion durch Austausch mit einem Hydroxidion aus der Falle freigesetzt und anschließend mit einer ionenselektiven Elektrode gemessen wird. Studien zur Fluoridbestimmung an Fingernagelproben mittels HMDS-gestützter Diffusion mit mindestens 5.0 mg Nagelmaterial von Erwachsenen berichten über Ergebnisse [ 14 ]. Bisherige Untersuchungen haben jedoch nicht den Einfluss einer geringen Zehennagelprobenmasse (in dieser Studie definiert als weniger als 5.0 mg) auf die Zuverlässigkeit der Fluoridbestimmung mit der HMDS-gestützten Diffusionsmethode untersucht. Es ist zudem wenig darüber bekannt, ob analytische Protokolle, die die HMDS-gestützte Diffusionsmethode verwenden, die Fluorid-Extraktionseffizienz (%FE) aus Zehennägeln beeinflussen. Eine Untersuchung dieser Frage könnte die methodische Standardisierung voranbringen. Daher verfolgte diese Studie folgende Ziele: (1) Bestimmung der minimalen Masse, die für eine zuverlässige Fluoridanalyse in Zehennagelproben erforderlich ist, und (2) Vergleich der %FE aus Zehennagelproben unter Verwendung zweier verschiedener Protokolle für die HMDS-gestützte Diffusion.

Studiendesign

Es wurde eine methodische Studie durchgeführt, um die minimale Zehennagelmasse zu bestimmen, die für eine zuverlässige Fluoridanalyse erforderlich ist, und um die Fluoridextraktionseffizienz zweier verschiedener Laborprotokolle zu vergleichen.

Beispielsammlung

Zehennagelproben mit einer mittleren Gesamtmasse von 49.5 ± 26.8 mg (Spanne: 22.4–104.6 mg) wurden von einer Gelegenheitsstichprobe von 11 weiblichen Teilnehmerinnen mit einem Durchschnittsalter von 30.7 ± 8.7 Jahren gesammelt. Die Teilnehmerinnen lebten in Toronto, Kanada, und fünf (45.5 %) befanden sich zwischen der 15. und 38. Schwangerschaftswoche. Schwangere und nicht-schwangere Teilnehmerinnen wurden in die Studie eingeschlossen, da frühere Forschungsergebnisse keine Unterschiede in der Nagelzusammensetzung aufgrund einer Schwangerschaft zeigten [ 29 ]. Alle Analysen wurden mit derselben Teilnehmergruppe durchgeführt, um potenzielle Schwankungen in der Exposition auszuschließen und methodische Unterschiede zu identifizieren. Die Teilnehmerinnen wurden angewiesen, Nagellack zu entfernen und ihre Zehennägel nach dem Baden oder Duschen zu schneiden. Anschließend gaben sie die abgeschnittenen Zehennägel entweder vom großen Zeh oder von anderen Zehen in separate Plastikbeutel. Alle Teilnehmerinnen unterzeichneten vor Beginn der Studie eine schriftliche Einverständniserklärung und genehmigten die Verwendung ihrer Proben für Studienzwecke. Die Zehennagelproben wurden aufbewahrt und zur Analyse an das Fluoridforschungslabor der zahnmedizinischen Fakultät der Indiana University versandt. Die Studienverfahren wurden von der Ethikkommission der York University in Toronto, Kanada, genehmigt.

Probenvorbereitung

Gesammelte Zehennagelproben wurden 2 Minuten lang in deionisiertem Wasser (diH₂O) ultraschallgereinigt und anschließend 4 Stunden bei 37 °C getrocknet (Abb. 1 ). Von jedem Teilnehmer wurden zufällig Zehennägel ausgewählt, mit einer ethanolgereinigten Laborschere geschnitten, gewogen und in Massen von 1.0 bis 5.0 mg (± 0.5 mg) gruppiert, um Replikate (Tabelle 1 ) für jeden Zehentyp (Großzehen und andere Zehen) zu erstellen, je nach Verfügbarkeit der Probenmassen. Nur vier Teilnehmer stellten Zehennagelproben von beiden Zehentypen zur Verfügung.

Für die Fluoridanalyse wurden insgesamt 98 Zehennagelproben präpariert. Die durchschnittliche Anzahl der analysierten Proben pro Teilnehmer betrug 9 (± 5), mit einer Spanne von 4–20. Die Masse der Zehennagelproben lag zwischen 0.80 und 5.50 mg (Tabelle 1 ).

Bestimmung des Fluoridgehalts

Abbildung 1 fasst die Studiendurchführung zusammen. Die vorliegende Studie folgte dem von Martinez-Mier et al. (2011) beschriebenen Verfahren. Zunächst wurde jede Zehennagelprobe auf den Boden einer Einweg-Petrischale (60 × 15 mm) gelegt und mit 2.0 ml deionisiertem Wasser (diH₂O) versetzt. Nach dem Auftragen von Vaseline auf die Innenseite des Deckels wurden 50 µl einer 0.05 N Natriumhydroxid-Lösung (NaOH) in fünf gleichen Tropfen auf jeden Deckel gegeben. Die Schalen wurden anschließend sofort dicht verschlossen. Mit einem Lötkolben wurde in jeden Deckel ein kleines Loch gebrannt, in das jeweils 1.0 ml HMDS-gesättigte 3 N Schwefelsäure (H₂SO₄ ) _{pipettiert und} das Loch sofort wieder mit Vaseline verschlossen. Nach Diffusion über Nacht bei Raumtemperatur wurde Fluorid freigesetzt und in der NaOH-Lösung gebunden. Die gebundene Lösung wurde entnommen und mit 25 µl 0.1 M Essigsäure gepuffert. Die gewonnene Lösung wurde mit deionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 µL eingestellt . Anschließend wurde die Fluoridkonzentration mittels einer fluoridselektiven Elektrode (Nachweisgrenze 0.019 mg/L) in Kombination mit einem pH/ISE-Meter (Orion™ Fluoridelektrode und Dual Star™ pH-Meter, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) gemessen. Eine Kalibrierkurve wurde anhand zehnfacher Verdünnungsreihen der auf das National Institute of Standards and Technology rückführbaren Orion™ ISE-Standardlösung (0.001 bis 2.00 µg/mL) nach demselben Verfahren erstellt. Die Millivolt-Messwerte der Proben wurden aufgezeichnet und der unbekannte Fluoridgehalt der Zehennagelproben mithilfe der Gleichung bestimmt, die den Zusammenhang zwischen dem Logarithmus der Fluoridkonzentration der Standards und den entsprechenden Millivolt-Messwerten beschreibt ( ^R² > 0.99).

Qualitätskontrollverfahren

Die Präzision des Assays wurde anhand der täglich verwendeten Kalibrierstandards über vier Analysetage hinweg ermittelt. Die mittlere Präzision innerhalb des Assays (Variationskoeffizient [VK] zwischen den täglichen Doppelbestimmungen über alle Standards) betrug 5.1 %. Die Präzision zwischen den Assays (VK für jeden Standard über die vier Analysetage) betrug 8.2 %.

Vergleich der Fluoridextraktionseffizienz und des Protokolls

Anhand von Zehennagelproben von vier zufällig ausgewählten Teilnehmern wurde die Fluorid-Extraktionseffizienz (%FE) mittels zweier Protokolle für die HMDS-gestützte Diffusion verglichen (Abb. 1 ). Um mögliche Schwankungen des Fluoridgehalts je nach Zehentyp zu minimieren, wurden ausschließlich Nagelproben von den übrigen Zehen (ohne Großzehe) verwendet. Nach der oben beschriebenen Ultraschallbehandlung mit deionisiertem Wasser (diH₂O) und Trocknung wurden von jedem Teilnehmer sechs Proben mit einem Gewicht von jeweils ca. 3.0 (± 0.5) mg zusammengeführt. Anschließend wurden drei Proben pro Teilnehmer zufällig der Fluoridanalyse nach Protokoll A und drei Proben dem Protokoll B zugeordnet, sodass pro Protokoll 12 Proben vorlagen. Jede Probe wurde drei aufeinanderfolgenden Analysen unterzogen (Erstanalyse gefolgt von zwei Wiederholungsanalysen), was zu 36 Fluoridmessungen pro Protokoll führte. Die beiden Protokolle nutzen die HMDS-vermittelte Diffusion, unterscheiden sich jedoch in der Menge an Reagenz und Wasser: Protokoll A verwendet 1.0 ml HMDS-gesättigte 3 NH₄SO₄-Lösung _und 2.0 ml _{deionisiertes} Wasser (siehe Abschnitt zur Fluoridgehaltsbestimmung), während Protokoll B 3.0 ml HMDS-gesättigte 3 NH₄SO₄-Lösung und 3.0 ml deionisiertes Wasser verwendet _. Die _{Fluoridausbeute} (%FE) wurde berechnet, indem die in jeder Analyse extrahierte Fluoridmenge (mg) durch die Summe der extrahierten Fluoridmengen (mg) aller Analysen dividiert und mit 100 multipliziert wurde. Die Fluoridmenge (mg) wurde durch Multiplikation des Probengewichts (g) mit dem Fluoridgehalt (µg/g) und anschließende Umrechnung in Milligramm (mg) bestimmt. Für jede Analyse wurden die Proben über Nacht bei 37 °C getrocknet und gewogen, um Massenveränderungen der Zehennägel nach der Einwirkung von HMDS-gesättigter Säure und Wasser zu berücksichtigen.

Statistische Analysen

Zur Zusammenfassung des Fluoridgehalts in Zehennagelproben wurden deskriptive Statistiken verwendet, darunter Maße der zentralen Tendenz (Median) und der Streuung (Interquartilsabstand [IQR] und Spannweite). Um die Variabilität des Fluoridgehalts nach Zehentyp (Großzehen vs. andere Zehen) zu beurteilen, wurde ein Mixed-Effects-Regressionsmodell mit invers transformiertem Fluorid als Zielvariable und robusten Standardfehlern unter Berücksichtigung von Wiederholungen innerhalb der Probanden angepasst. Zur Beurteilung der Variabilität innerhalb der Probanden und zur Festlegung eines minimalen Schwellenwerts der Zehennagelmasse für eine zuverlässige Fluoridmessung wurden Intraclass-Korrelationskoeffizienten (ICC) für Masseninkremente von 0.50 mg mithilfe der Varianzkomponenten linearer Mixed-Effects-Modelle berechnet, wobei der Proband als zufälliger Achsenabschnitt spezifiziert wurde. Die Interpretation der ICC-Werte erfolgte nach Koo und Li [ 30 ], wobei Werte < 0.5 eine geringe, 0.5–0.75 eine mittlere, 0.75–0.9 eine gute und > 0.90 eine ausgezeichnete Zuverlässigkeit anzeigen. Mithilfe von 1,000 Resamples im Mixed-Effects-Modell wurden mittels Bootstrapping 95%-Konfidenzintervalle geschätzt. Um die Masse zu ermitteln, bei der sich der Fluoridgehalt der Zehennägel in Abhängigkeit von der Zehennagelmasse signifikant verändert, wurde eine Change-Point-Analyse mit Cluster-Bootstrapping [ 31 ] durchgeführt, wobei die Variabilität zwischen den Teilnehmern berücksichtigt wurde. Das 95%-Konfidenzintervall für den Change-Point wurde mit 1000 Cluster-Bootstrap-Replikaten geschätzt. Die Normalverteilung der %FE-Werte beider Protokolle wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test geprüft (p > 0.05). Die Varianz der %FE-Werte zwischen den Protokollen wurde mit einem F -Test auf Varianzgleichheit verglichen. Die statistische Signifikanz wurde auf p < 0.05 festgelegt. Alle Analysen wurden mit R (Version 4.4.2) und Stata (Version 19, Stata Corp.) durchgeführt.

Bestimmung der minimalen Masse, die für eine zuverlässige Fluoridanalyse in Zehennägeln erforderlich ist.

Der Median (IQR) des Fluoridgehalts aller Zehennagelproben (n = 98) betrug 2.07 (1.53) µg F⁻ ^/ g und lag zwischen 0.82 und 9.22 µg F⁻ ^/ g. Beim Vergleich des Fluoridgehalts in Zehennägeln nach Zehentyp wiesen Nägel der Großzehen (n = 25) einen höheren Median (IQR) [1.98 (1.50) µg F⁻/g] auf ^als Nägel der übrigen Zehen (n = 25) [1.55 (1.27) µg F⁻ ^/ g]. Dieser Unterschied zwischen den Zehentypen war jedoch statistisch nicht signifikant ( p = 0.32).

Die Verteilung des Fluoridgehalts in Zehennägeln in Abhängigkeit von der Masse der Probenreplikate für jeden Teilnehmer ist in Datei S1 dargestellt . Es wurden Mixed-Effects-Modelle berechnet, um die Gesamtvarianz und die Varianz zwischen den Probanden zu bestimmen, und Intraclass-Korrelationskoeffizienten (ICC) für 0.5-mg-Schritte der Zehennagelmasse ermittelt. Bei einer minimalen Zehennagelmasse von 2.5 mg zeigten die Fluoridmessungen eine sehr hohe bis exzellente Reliabilität (ICC = 0.90, 95 %-KI: [0.71; 0.95], Abb. 2 ). Eine Change-Point-Analyse ergab ebenfalls eine signifikante Verschiebung des Fluoridgehalts bei einer Zehennagelmasse von 2.2 mg (95 %-KI: [1.70; 2.70 mg]), die scheinbar unabhängig von der Masse darüber hinaus ist.

Vergleich der Fluorid-Extraktionseffizienz aus Zehennagelproben unter Verwendung zweier unterschiedlicher Protokolle mit HMDS-unterstützter Diffusion.

Tabelle 2 zeigt den Fluoridgehalt und die Fluoridextraktionseffizienz (%FE) für jede Analyse bzw. Wiederholungsanalyse derselben Proben. Der Median des Fluoridgehalts und der %FE variierte zwischen den Analysen für beide Protokolle, wobei Protokoll A im Vergleich zu Protokoll B eine geringere Streuung der %FE-Werte aufwies. Insbesondere war die Varianz der %FE für Protokoll A ( Variable = 32.0) signifikant niedriger als die Varianz der %FE für Protokoll B ( Variable = 137.7), mit F = 0.23 und p = 0.02.