miR-23b-5p: Ein potenzieller Biomarker bei fluoridinduzierten neurologischen Schäden.

… 3. Ergebnis

3.1. Allgemeiner Zustand von fluoridexponierten Ratten und Fluoridgehalt in Urin, Blut und Hirngewebe

Die Ergebnisse zeigten, dass das Körpergewicht der mit Fluorid exponierten Ratten im Vergleich zur Kontrollgruppe dosisabhängig abnahm (p<0.01, Abb.. 1A), während das Verhältnis von Gehirn- zu Körpergewicht mit steigenden Fluoridkonzentrationen zunahm (p<0.01, Abb.. 1B) Dies könnte daran liegen, dass die hemmende Wirkung von Fluorid auf das Gesamtwachstum deutlich stärker war als seine Wirkung auf das Gehirn. Selbst bei einer leichten Abnahme des Gehirngewichts würde dessen Anteil am Körpergewicht daher dennoch zunehmen. Um die Fluoridbelastung zu beurteilen, untersuchten wir bei Ratten Fluorid im Urin, Serum und Gehirn sowie die Zahnfluorose. Wie in Abbildung 1 gezeigt, … Abb.. 1Bei CE waren die Fluoridkonzentrationen im Urin, im Serum und im Gehirn der Ratten nach 12 Wochen freier Wasseraufnahme höher als in der Kontrollgruppe.p<0.05). Die Zähne der Ratten in der Kontrollgruppe waren durchscheinend und glänzend. Im Gegensatz dazu entwickelten Ratten, die 25 mg/L NaF ausgesetzt waren, eine geringe Anzahl weißer Plaques auf der Zahnoberfläche. Bei Ratten, die 50 mg/L und 100 mg/L NaF ausgesetzt waren, zeigten die Zähne horizontale Streifen mit unterschiedlichen Graden gelber und weißer Verfärbung, begleitet von verminderter Durchscheinbarkeit und deutlichen Schäden an der Zahnstruktur (Abb.. 1F). Die obigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Fluorid-exponierte Rattenmodell erfolgreich etabliert wurde.

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Abb.. 1Allgemeiner Zustand fluoridexponierter Ratten und Fluoridgehalt in Urin, Blut und Hirngewebe. (A) Gewicht der Ratten. (B) Verhältnis von Gehirn- zu Körpergewicht der Ratten. (C) Fluorid im Urin der Ratten. (D) Fluorid im Serum der Ratten. (E) Fluorid im Gehirn der Ratten. (F) Zahnfluorose bei Ratten. n=20, *p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 im Vergleich zur Kontrollgruppep.

3.2. Fluoridbelastung führte bei Ratten zu Hirngewebeschäden.Um die Auswirkungen von Fluorid auf Hirnschäden zu untersuchen, wurde der Morris-Wasserlabyrinth-Test (MWM) eingesetzt, um die räumlichen Lern- und Gedächtnisfähigkeiten von Ratten zu beurteilen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Latenzzeit bis zum Auffinden der Plattform in der fluoridexponierten Gruppe signifikant länger war als in der Kontrollgruppe.p<0.01, Abb.. 2A). Nach Entfernung der Plattform war die Häufigkeit des Überquerens des Zielquadranten in der fluoridexponierten Gruppe signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe (p<0.01, Abb.. 2B) Die Ergebnisse des täglichen Trainings zeigten, dass die durchschnittliche Latenzzeit der Ratten in der Fluorid-exponierten Gruppe jeden Tag signifikant länger war als in der Kontrollgruppe.Abb.. 2C). Die Schwimmwege der fluoridexponierten Gruppe waren im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe stärker gestreut und unorganisiert (Abb.. 2D) Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Fluoridexposition das räumliche Lern- und Erinnerungsvermögen bei Ratten beeinträchtigte.

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Abb.. 2Fluoridbelastung führte bei Ratten zu Hirngewebeschäden. (A) Latenzzeit der Ratten bis zum Auffinden der Plattform. n=5 (B) Anzahl der Überquerungen des Zielquadranten durch die Ratten. n=5 (C) Tägliche Fluchtlatenz der Ratten. n=5 (D) Schwimmbahnen der Ratten während der räumlichen Erkundungsphase. n=5 (E) H&E-Färbung von Großhirnrinde und Hippocampus der Ratten. Rote Kästchen markieren Zellkörperschrumpfung und -fragmentierung. Schwarze Pfeile markieren Kernpyknose und -auflösung. Orange Pfeile markieren Zellkörperfragmentierung mit Vakuolenbildung. n=5 (F) Nichols-Färbung des Hippocampus der Ratte. n=5 (G) Neuronale Dichte im Hippocampus der Ratte. n=5 (H) Veränderungen neuronaler Organellen im Rattenhirngewebe, beobachtet mittels Elektronenmikroskopie. Rote Pfeile markieren mitochondriale Schwellung und Fragmentierung der mitochondrialen Cristae. Gelbe Pfeile markieren das Fehlen der Kernhüllenstruktur. Blaue Pfeile markierten die Chromatinmarginalisierung. Grüne Pfeile markierten Mikrotubulibrüche und eine lockere Gewebestruktur. Violette Pfeilspitzen markierten zytoplasmatische Vakuolen. n=5 (I) BDNF-Proteinexpression im Rattenhirnrinde. n=3 (J) Quantitative Analyse der BDNF-Proteinexpression im Rattenhirnrinde. n=3, ** p<0.01, **** p<0.0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Um die durch Fluoridexposition verursachten neurologischen Schäden eingehend zu untersuchen, wurden in dieser Studie histopathologische Veränderungen im Rattenhirngewebe systematisch beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellen in der Kontrollgruppe geordnet angeordnet waren und eine einheitliche zytoplasmatische Färbung aufwiesen. In der 25-mg/L-Gruppe waren die Strukturen des Großhirns und des Hippocampus der Ratten klar erkennbar und wiesen keine offensichtlichen strukturellen Schäden auf; in den 50-mg/L- und 100-mg/L-Gruppen zeigten die Zellkörper im Großhirn jedoch eine signifikante Schrumpfung mit verschwommener Gewebeschichtung und ungeordneter Zellanordnung. Zusätzlich war eine große Anzahl von Pyramidenzellen in der Hippocampusregion reduziert, und die Zellkörper waren fragmentiert und wiesen Vakuolenbildung auf.Abb.. 2E). Die Nissl-Färbung zeigte, dass die Neuronen in der CA1-Region des Hippocampus der Kontrollgruppe intakt, dicht angeordnet und reich an Nissl-Körpern waren, während die Hochdosisgruppe eine signifikante Reduktion der Anzahl der Neuronen und eine lockere Anordnung aufwies (Abb.. 2F). Die quantitative Analyse ergab, dass die neuronale Dichte in den fluoridexponierten Gruppen signifikant niedriger war (p<0.001) und zeigte einen dosisabhängigen abnehmenden Trend mit zunehmender Fluoridexposition (Abb.. 2G). Unter dem Elektronenmikroskop wurden in der 25-mg/L-Gruppe mitochondriale Schwellungen und eine Fragmentierung der mitochondrialen Cristae beobachtet. In der 50-mg/L-Gruppe wurden in Neuronen eine Fragmentierung der mitochondrialen Cristae und ein teilweiser Verlust der Doppelschichtstruktur der Kernhülle festgestellt. In der 100-mg/L-Gruppe kam es zu einer Chromatinmarginalisierung; zusätzlich zeigten die Mikrotubuli eine geringe Kontinuität mit starken Brüchen und einer lockeren Gewebestruktur, begleitet von zytoplasmatischen Vakuolen und einer Fragmentierung oder dem Verschwinden der mitochondrialen Cristae.Abb.. 2H). Anschließend wurde der Proteinspiegel von BDNF, einem Schlüsselfaktor für Hirnschädigungen in der Großhirnrinde von Ratten, bestimmt (Abb.. 2I, J). Die Ergebnisse zeigten, dass der BDNF-Proteinspiegel in der 100 mg/L NaF-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant reduziert war (p<0.001). Die obigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Fluoridexposition zu dosisabhängigen neurologischen Schäden führen kann, deren Ausmaß eng mit der Expositionsdosis zusammenhängt.

3.3. Fluoridexposition induzierte Schädigung von SH-SY5Y-Zellen.Auf Grundlage des RTCA-Tests wurde ermittelt, dass 30 mg/L NaF für die Konstruktion des Fluor-induzierten SH-SY5Y-Zellschädigungsmodells verwendet werden sollten.Abb.. 3A) Bei dieser Dosis war die Aktivität der SH-SY5Y-Zellen signifikant niedriger als die der Kontrollgruppe und lag im sicheren Überlebensbereich (Aktivität > IC₅₀).₅₀), wodurch der Zellzustand für die nachfolgende Detektion sichergestellt und eine Schädigung der SH-SY5Y-Zellen induziert werden könnte. Die weitere Untersuchung der BDNF-Proteinspiegel in SH-SY5Y-Zellen zeigte, dass die BDNF-Proteinexpression in der 30 mg/L NaF-Gruppe signifikant niedriger war als in der Kontrollgruppe (p<0.05, Abb.. 3B, C).

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Abb.. 3Fluorid-Exposition induzierte Schädigungen von SH-SY5Y-Zellen. (A) Nachweis der SH-SY5Y-Zellaktivität zu verschiedenen Zeitpunkten und nach Exposition gegenüber unterschiedlichen Natriumfluorid-Dosen. (B) BDNF-Proteinexpression in SH-SY5Y-Zellen. (C) Quantitative Analyse der BDNF-Proteinexpression in SH-SY5Y-Zellen. (D) Apoptose in SH-SY5Y-Zellen. (E) Quantifizierung der frühen, späten und gesamten Apoptose in SH-SY5Y-Zellen. *p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Die Auswirkungen der Fluoridexposition auf die Apoptose von SH-SY5Y-Zellen wurden gezeigt in Abb.. 3DG. Die Ergebnisse zeigten, dass 30 mg/L NaF die Apoptose von SH-SY5Y-Zellen signifikant auf das 2.31-Fache der Kontrollgruppe erhöhte (p<0.01). Diese Daten bestätigten die schädigende Wirkung der Fluoridexposition auf SH-SY5Y-Zellen.

3.4. RNA-Sequenzierung ergab, dass Fluorid die miR-23b-5p-Expression im Hirngewebe von fluoridexponierten Ratten erhöhte.Die miRNA-Expressionsprofile von Hirngewebe fluoridexponierter und Kontrollratten wurden mittels Hochdurchsatzsequenzierung analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass 40 differentiell exprimierte miRNAs im zerebralen Kortex identifiziert wurden (19 hochreguliert und 21 herunterreguliert). Abb.. 4A) und 33 unterschiedlich exprimierte miRNAs wurden im Hippocampus nachgewiesen (16 hochreguliert und 17 herunterreguliert, Abb.. 4B). Die Heatmap-Analyse ergab spezifische Expressionsmuster dieser miRNAs (Abb.. 4Neun differentiell exprimierte miRNAs wurden sowohl im zerebralen Kortex als auch im Hippocampus gefunden, was auf deren mögliche Beteiligung an den gemeinsamen Regulationsmechanismen der Fluorid-Neurotoxizität hindeutet. Unter ihnen zeigte miR-23b-5p die signifikanteste Expressionsänderung und wird als zentrales regulatorisches Molekül vermutet, das fluoridinduzierte neurologische Schäden vermittelt.

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Abb.. 4RNA-Sequenzierung zeigte, dass Fluorid die miR-23b-5p-Expression im Hirngewebe fluoridexponierter Ratten erhöhte. (A) Vulkan-Diagramm der differentiell exprimierten miRNAs im Kortex. (B) Vulkan-Diagramm der differentiell exprimierten miRNAs im Hippocampus. (C) Heatmap der differentiell exprimierten miRNAs im Kortex. (D) Heatmap der differentiell exprimierten miRNAs im Hippocampus. n = 3.

3.6. Fluoridexposition erhöhte die miR-23b-5p-Expression in Rattenhirngewebe und SH-SY5Y-Zellen.

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Abb.. 6Fluoridexposition führte zu einer Hochregulation der miR-23b-5p-Expression im Hirngewebe von Ratten und in SH-SY5Y-Zellen. (A) Expression von miR-23b-5p im Großhirnrindenbereich von Ratten. (B) Expression von miR-23b-5p im Hippocampus von Ratten. (C) Expression von miR-23b-5p in SH-SY5Y-Zellen. n=3, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Bei SH-SY5Y-Zellen war der miR-23b-5p-Expressionsgrad nach Behandlung mit 30 mg/L NaF im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht (p<0.001, Abb.. 6C). Die Ergebnisse der Tier- und Zellmodelle waren konsistent und bestätigten, dass die Fluoridexposition die miR-23b-5p-Expression hochreguliert.

3.7. miR-23b-5p vermittelte Fluorid-induzierte Apoptose in SH-SY5Y-Zellen

Um zu untersuchen, ob miR-23b-5p die Fluorid-induzierte Apoptose in SH-SY5Y-Zellen vermittelt, wurden funktionelle Validierungsexperimente durch Hemmung der miR-23b-5p-Expression durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Exposition gegenüber 30 mg/L NaF über 12 h die BDNF-Expression in SH-SY5Y-Zellen signifikant hemmte, während die Hemmung von miR-23b-5p die Expression von BDNF signifikant erhöhte.p<0.05). Der BDNF-Expressionsgrad in der Inhibitorgruppe war signifikant höher als in der Kombinationsbehandlungsgruppe (p<0.01, Abb.. 7AB), was darauf hindeutet, dass die Hemmung von miR-23b-5p die BDNF-Expression in Abwesenheit von Fluoridexposition effektiver fördern kann. Neuronale Apoptose-Assays zeigten, dass die NaF-Behandlung die Apoptose signifikant erhöhte (p<0.05, Abb.. 7CF), und die Apoptose war in der Inhibitorgruppe reduziert (p<0.05). Die Apoptose in der Gruppe mit gemeinsamer Behandlung war signifikant geringer als in der NaF-Gruppe (pDie Ergebnisse (p < 0.0001) deuten darauf hin, dass die Hemmung von miR-23b-5p die Fluorid-induzierte Apoptose in SH-SY5Y-Zellen teilweise rückgängig machen könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass miR-23b-5p die Fluorid-induzierte Apoptose in SH-SY5Y-Zellen vermitteln könnte.

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Abb.. 7miR-23b-5p vermittelt Fluorid-induzierte Apoptose in SH-SY5Y-Zellen. (A) BDNF-Proteinexpression in SH-SY5Y-Zellen nach Transfektion mit einem miR-23b-5p-Inhibitor. (B) Quantifizierung der BDNF-Proteinexpression in SH-SY5Y-Zellen nach Transfektion mit einem miR-23b-5p-Inhibitor. (C) Apoptose von SH-SY5Y-Zellen nach Transfektion mit einem miR-23b-5p-Inhibitor. (D) Quantifizierung der frühen, späten und gesamten Apoptose in SH-SY5Y-Zellen nach Transfektion mit einem miR-23b-5p-Inhibitor. *p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe. ### p<0.001, #### p<0.0001 im Vergleich zur NaF-Gruppe. ++ p<0.01 im Vergleich zur Inhibitorgruppe.

3.8. miR-23b-5p als potenzieller Biomarker für fluoridinduzierte neurologische Schäden in Populationen

Die Ergebnisse der Mediationsanalyse (Abb.. 8) zeigten, dass die Fluoridkonzentration im Urin einen signifikanten positiven Effekt auf miR-23b-5p hatte (a=1.28, p<0.001), während miR-23b-5p einen signifikanten negativen Effekt auf BDNF ausübte (b=-1099, p<0.05). Weitere Analysen ergaben, dass die direkte hemmende Wirkung von Fluorid im Urin auf BDNF c' = -1581.9 betrug (p<0.05), und der Gesamteffekt einschließlich der vermittelnden Rolle betrug c = -2992.1 (p<0.001). Unter diesen war der indirekte Effekt, der durch miR-23b-5p vermittelt wird (ab=-1410, pDer p-Wert (p < 0.05) trug zu 47.1 % zum Gesamteffekt bei. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fluoridexposition nicht nur die BDNF-Expression direkt hemmt, sondern auch den BDNF-Abfall durch Hochregulierung von miR-23b-5p verstärkt. Dies legt nahe, dass miR-23b-5p als wichtiger Mediator im Zusammenhang zwischen Fluoridexposition und Markern neurologischer Schädigung fungiert. Sein Wert als potenzieller Biomarker verdient daher Beachtung.

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Abb.. 8Diagramm des vermittelnden Signalwegs, über den Fluorid im Urin BDNF über miR-23b-5p beeinflusst.

4. Diskussion

Die Früherkennung und die mechanistische Analyse von fluoridbedingten neurologischen Schäden haben sich zu internationalen Forschungsschwerpunkten entwickelt. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass eine langfristige Fluoridexposition signifikant mit kognitiven Funktionsstörungen, Gedächtnisverlust und einem erhöhten Risiko für neurodegenerative Erkrankungen verbunden ist.Russ et al., 2020, Li et al., 2016, NTP-Monographie, 2024Aufgrund der Latenz und Irreversibilität neurologischer Schäden stellen Früherkennung und Intervention erhebliche Herausforderungen dar. Daher ist die Erforschung hochsensitiver und spezifischer Biomarker von großer Bedeutung für die Früherkennung und das mechanistische Verständnis fluoridinduzierter neurologischer Schäden. Diese Studie, die sich auf das Screening von Biomarkern für fluoridinduzierte neurologische Schäden konzentrierte, bestätigte durch multidimensionale Untersuchungen, dass miR-23b-5p als potenzieller Biomarker für diese Schäden dienen kann. Die Studie liefert wichtige theoretische Grundlagen für die Früherkennung von Fluorose, die Entwicklung präventiver Strategien und das Screening präziser Interventionsziele und bietet somit neue Ansätze und eine solide wissenschaftliche Basis für die Prävention und Behandlung fluoridinduzierter neurologischer Schäden.

Die durch Fluorid verursachten neurologischen Schäden wurden in verschiedenen Forschungsarbeiten bestätigt. Epidemiologische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Fluoridexposition negativ mit kognitiven Beeinträchtigungen korreliert (Grandjean und Landrigan, 2014), wobei der langfristige Konsum von fluoridreichem Wasser mit signifikant reduzierten IQ-Werten bei Kindern und einer Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen dem Fluoridgehalt im Urin und kognitiven Funktionsstörungen in Verbindung gebracht wird (Choi et al., 2015In Tierversuchen stimmten die Ergebnisse unserer Studie weitgehend mit denen von Rocha-Amador et al. überein (Rocha-Amador et al., 2007MWM-Tests zeigten eine verlängerte Fluchtlatenz und weniger Plattformüberquerungen bei fluoridexponierten Ratten, was mit den von Valdez-Jiménez et al. berichteten Defiziten im räumlichen Lernen und Gedächtnis übereinstimmt.Valdez-Jiménez et al., 2011Histopathologische Untersuchungen zeigten eine desorganisierte Neuronenanordnung und eine reduzierte Anzahl von Nissl-Körperchen in der CA1-Region des Hippocampus von fluoridexponierten Ratten, während die Elektronenmikroskopie ultrastrukturelle Veränderungen wie neuronale Mitochondrienschwellungen und Cristae-Fragmentierung aufdeckte. In-vitro-Experimente zeigten, dass die Exposition von SH-SY5Y-Zellen gegenüber 30 mg/L NaF über 12 Stunden zu einem Anstieg der Apoptoserate führte, was mit den von Ke et al. und Zhou et al. berichteten Ergebnissen zur fluorinduzierten neuronalen Apoptose übereinstimmt.Ke et al., 2016). und Zhou et al (Zhou et al., 2019Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Exposition gegenüber Fluorid bei Ratten kognitive und neurologische Schäden hervorruft.

In dieser In-vivo-Studie verwendeten wir drei NaF-Expositionsdosen: 25, 50 und 100 mg/L. Nach der Umrechnung betrugen die entsprechenden humanen Äquivalenzdosen etwa 3.9, 7.9 bzw. 15.8 mg/L. Die WHO empfiehlt einen Grenzwert von 1.5 mg/L für die Fluoridkonzentration im Trinkwasser. In einigen Gebieten mit hoher Fluoridbelastung können die Fluoridwerte im Trinkwasser jedoch bis zu 20 mg/L erreichen und damit den WHO-Richtwert deutlich überschreiten. Daher war die Verwendung dieser Dosen für die Untersuchung der gesundheitlichen Auswirkungen einer hohen Fluoridbelastung gerechtfertigt. Darüber hinaus wurde das Drei-Dosen-Design angewendet, um die minimale effektive Dosis zu bestimmen, die erforderlich ist, um neuronale Schäden hervorzurufen und die miR-23b-5p-Expression zu verändern, um zu beobachten, ob sich die Effekte mit steigender Dosis verstärken, und um sicherzustellen, dass die Dosis von 100 mg/L typische neuropathologische Phänotypen im Zusammenhang mit Fluorose innerhalb eines relativ kurzen Versuchszeitraums zuverlässig reproduzieren kann. Die Gründe für die Festlegung der Fluoridexpositionsdauer auf 12 Wochen in dieser Studie sind folgende: Ein Zeitraum von 12 Wochen (3 Monaten) gilt in der toxikologischen Forschung allgemein als subchronische Expositionsdauer. Sein Hauptvorteil liegt in seiner Fähigkeit, typische pathologische Phänotypen der Fluoridtoxizität bei Ratten stabil hervorzurufen. Bisherige Studien haben gezeigt, dass eine Fluoridexposition von entweder 3 oder 6 Monaten bei Ratten Schäden verursachen kann, wie z. B. erhöhte Fluoridwerte im Urin, deutliche Zahnfluorose und kognitive Dysfunktion.Wang et al., 2023b, Dong et al., 2024Aus wirtschaftlicher Sicht kann eine Expositionsdauer von 12 Wochen die Tierfutterkosten deutlich senken und den Versuchszyklus verkürzen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Wahl einer 12-wöchigen Fluoridexposition in dieser Studie nicht nur den klassischen Designstandards für subchronische Toxizitätsmodelle entspricht, sondern auch die Durchführbarkeit und Wirtschaftlichkeit des Experiments in Einklang bringt und somit eine stabile Modellgrundlage für nachfolgende Untersuchungen der mit Fluoridexposition verbundenen toxischen Mechanismen bietet. Der Fluoridgehalt im Urin ist ein zentraler Indikator für die interne Fluoridbelastung. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die Fluoridkonzentrationen im Urin von Ratten mit höheren Expositionsdosen anstiegen, was die erfolgreiche Etablierung des Fluoridexpositionsdosismodells direkt bestätigte und eine Grundlage für weitere Forschung schuf. Dies unterscheidet sich jedoch von der tatsächlichen Situation einer langfristigen Exposition gegenüber niedrigen Fluoridkonzentrationen beim Menschen. Daher können in zukünftigen Studien Modelle mit niedrigeren Konzentrationen und längeren Expositionsdauern eingesetzt werden, um entsprechende Untersuchungen durchzuführen.

BDNF ist ein wichtiger molekularer Marker, der neurologische Schäden widerspiegelt (Autry und Monteggia, 2012Klinische Studien zeigten, dass die Serum-BDNF-Spiegel bei Alzheimer-Patienten negativ mit dem Schweregrad der Erkrankung korrelierten (Laske et al., 2007), chronischer Stress führte zu einer anhaltenden Herabregulierung der BDNF-Expression im Hippocampus (Duman und Monteggia, 2006Mehrere Neurotoxine induzieren BDNF-Expressionsanomalien, die klinischen Symptomen vorausgehen. Diese Studie ergab, dass Fluoridexposition den BDNF-Spiegel sowohl im zerebralen Kortex als auch in SH-SY5Y-Zellen senkte. Populationsanalysen zeigten eine negative Korrelation zwischen Fluorid im Urin und BDNF, was mit früheren Befunden übereinstimmt und die universelle Anwendbarkeit von BDNF als Marker für neurologische Schädigungen bestätigt. Bisherige Forschungsergebnisse zeigten, dass subchronische Fluoridexposition die BDNF-Protein-Expression im Hippocampus von Ratten um 40 % reduzierte, begleitet von Beeinträchtigungen des räumlichen Gedächtnisses.Niu et al., 2009), was mit den Ergebnissen dieser Studie übereinstimmt. Frühere Studien wiesen darauf hin, dass fluoridbedingte neurologische Schäden auch Veränderungen bei einer Reihe anderer Indikatoren verursachen können, darunter Indikatoren für oxidativen Stress (z. B. ROS, MDA, SOD) (Barbier et al., 2010), entzündungsfördernde Zytokine (TNF-a, IL-6 usw.) (Fu et al., 2022), synaptische Plastizitätsproteine ​​(PSD-95 usw.) (Zhu et al., 2011In dieser Studie wurde BDNF als Markerprotein für neurologische Schädigungen ausgewählt, da es als zentraler Regulator des neuronalen Überlebens und der synaptischen Plastizität direkt mit der kognitiven Funktion zusammenhängt und periphere BDNF-Spiegel neurologische Schädigungen widerspiegeln können. Obwohl BDNF Vorteile als Marker bietet, beruhen neurologische Schädigungen auf synergistischen Interaktionen innerhalb multimolekularer Netzwerke. Zukünftige Studien könnten weitere Moleküle, die mit neurologischen Schädigungen in Zusammenhang stehen (z. B. NGF, NT-3, Indikatoren für oxidativen Stress und Entzündungen), in gemeinsamen Tests einbeziehen, um ein umfassenderes Bewertungssystem für fluoridinduzierte neurologische Schädigungen zu entwickeln.

In den letzten Jahren wurden Fortschritte in der Fluoridforschung und ihren Auswirkungen auf das Nervensystem erzielt. Dabei werden verschiedene Biomarker zur Beurteilung fluoridbedingter neurologischer Schäden eingesetzt. Traditionelle Studien konzentrierten sich auf Marker für oxidativen Stress (z. B. ROS, MDA) und Entzündungsfaktoren (z. B. TNF-α).aIL-6), die zwar auf zelluläre Schäden durch Fluoridexposition hinweisen, weisen jedoch keine Gewebespezifität auf und treten erst spät im Verlauf der Erkrankung auf. Mit der Vertiefung der epigenetischen Forschung haben sich microRNAs als neuartige Biomarker mit Vorteilen herausgestellt, und ihre Zusammenhänge mit neurologischen Erkrankungen wurden vielfach beschrieben (Chandran et al., 2024, Banack et al., 2024Beispielsweise ist das Serum-miR-124-3p bei Parkinson-Patienten herunterreguliert (Esteves et al., 2022), miR-155 moduliert die Mikroglia-Funktion über IFN-y Signalgebung zur Verbesserung der Kognition bei Alzheimer (Yinet al., 2023), und miR-29c-3p wurde auch mit der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht (Sha et al., 2021Insbesondere in Modellen neurologischer Verletzungen korrelierten Veränderungen der miR-23b-Expression eng mit dem Fortschreiten der Nervenverletzung. Studien zeigten, dass miR-23b GnT-III als Zielstruktur haben und den Akt/GSK-3-Signalweg aktivieren kann.B Signalweg zur Hemmung der Tau-Protein-Pathologie und veränderte die Verarbeitung des Amyloid-Vorläuferproteins (ABPP), um oxidativen Stress zu unterdrücken und dadurch kognitive Beeinträchtigungen und pathologische Symptome im Zusammenhang mit Alzheimer zu verbessern (Pan et al., 2021In einem Rattenmodell für zerebrale Ischämie-Reperfusion-induzierte neurologische Schäden war die miR-23b-Expression herunterreguliert und förderte die Apoptose von Hippocampusneuronen durch die Regulierung des TAB3/NF-Signalwegs._kB/p53-Achse (Roshan-Milani et al., 2022); Schwann-Zellen, die mechanischer Stimulation ausgesetzt sind, geben miR-23b-3p über ihre extrazellulären Vesikel an Neuronen ab, wodurch die Expression von Neuropilin 1 (Nrp1) in Neuronen herunterreguliert und die axonale Regeneration gefördert wird (Xia et al., 2020Diese Studie identifizierte eine entscheidende Rolle von miR-23b-5p bei fluoridinduzierten neurologischen Schäden: Seine Expression war sowohl in Tiermodellen als auch in SH-SY5Y-Zellmodellen nach Fluoridexposition signifikant erhöht. Eine wichtige Folgefrage lautet: Wie reguliert Fluorid die Expression von miR-23b-5p? Obwohl diese Studie die vorgelagerten Mechanismen nicht direkt untersuchte, schlagen wir basierend auf den bekannten toxikologischen Wirkungen von Fluorid und den regulatorischen Eigenschaften von miR-23b-5p mehrere plausible Möglichkeiten zur Validierung in zukünftigen Studien vor. Erstens ist oxidativer Stress wahrscheinlich ein wichtiger vorgelagerter Faktor. Zahlreiche Studien haben bestätigt, dass Fluoridexposition rasch einen starken Anstieg des intrazellulären Gehalts an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) induziert.Li et al., 2024ROS wirken nicht nur als Effektormoleküle, sondern auch als wichtige Signalmoleküle, die Transkriptionsfaktoren wie NF-κB aktivieren können._kB und p53 (Li et al., 2022b, Zhang et al. 2025Diese Transkriptionsfaktoren können direkt an die Promotorregion von miR-23b-5p binden und dessen Transkription steuern. Zweitens könnte Neuroinflammation eine vermittelnde Rolle spielen. Fluorid kann Gliazellen aktivieren und dadurch die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine wie TNF-α auslösen.a und IL-1B (Wang et al., 2024Diese Entzündungsmediatoren können parakrin auf Neuronen wirken und die Expression von miR-23b-5p indirekt regulieren, indem sie deren Oberflächenrezeptoren (z. B. TNFR) aktivieren.Li et al., 2021) und nachgeschaltete Signalwege (Yang et al., 2022Darüber hinaus darf die epigenetische Reprogrammierung nicht außer Acht gelassen werden. Fluorid kann die Chromatinzugänglichkeit des miR-23b-5p-Genlocus durch Mechanismen wie die Regulierung der DNA-Methylierung oder Histonmodifikation verändern und dadurch die Hemmung seiner Transkription aufheben und seine Expression fördern (Yamashita et al., 2024, Dey Bhowmik et al., 2023In der Populationsanalyse spiegelte die negative Korrelation zwischen Fluoridkonzentration im Urin und BDNF nicht nur einen direkten inhibitorischen Effekt wider, sondern auch eine Verstärkung des BDNF-Abfalls durch Hochregulation von miR-23b-5p. Die Mediationsanalyse zeigte, dass etwa 47.1 % der fluoridinduzierten BDNF-Reduktion durch miR-23b-5p vermittelt wurden. Dieser Befund lieferte humane Evidenz für den Zusammenhang zwischen Fluoridexposition, Regulation nicht-kodierender RNA und neurologischer Schädigung und legt nahe, dass miR-23b-5p als potenzieller Biomarker für die Verbindung zwischen Fluoridexposition und neurologischer Schädigung dienen könnte. Obwohl in dieser Studie versucht wurde, Verzerrungen durch Störfaktoren mittels strenger Ein- und Ausschlusskriterien zu minimieren (z. B. Berücksichtigung der Wohndauer und Ausschluss schwerwiegender chronischer Erkrankungen), ist aufgrund des Beobachtungscharakters der Studie dennoch Vorsicht hinsichtlich des potenziellen Einflusses unkontrollierter Störfaktoren auf die Ergebnisse geboten. Im Hinblick auf die Ernährung können Mineralstoffe wie Kalzium und Magnesium die Fluoridbelastung im Körper verändern, indem sie die Fluoridaufnahme und den Fluoridstoffwechsel beeinflussen, während antioxidative Nährstoffe den durch Fluorid verursachten oxidativen Stress lindern können (Tao et al., 2022, Tefera et al., 2022Eine unzureichende Berücksichtigung von Ernährungsunterschieden könnte die Aussagekraft des Zusammenhangs zwischen Fluorid und miR-23b-5p beeinträchtigen. Auch Unterschiede im genetischen Hintergrund dürfen nicht außer Acht gelassen werden: Genetische Polymorphismen in Enzymen des Fluoridstoffwechsels (z. B. UGT, GST) und in den regulatorischen Regionen von miR-23b-5p können zu individuellen Unterschieden in den Reaktionen auf Fluoridexposition führen und somit die Interpretation der Ergebnisse beeinflussen.Er und andere, 2023Zukünftige Forschung sollte Biomarker-Profiling und Genomanalysen integrieren, um ernährungsbedingte und gleichzeitige Expositionsfaktoren präzise zu kontrollieren und die genetische Prädisposition aufzuklären. Dadurch könnten die kausalen Zusammenhänge und die individuelle Variabilität fluoridbedingter neurologischer Schäden verdeutlicht werden. Bioinformatische Analysen (TargetScan- und miRDB-Datenbanken) identifizierten potenzielle Bindungsstellen für miR-23b-5p am cAMP-Response-Rezeptor-bindenden Protein 1 (CREB1). Proteomische Analysen zeigten, dass die CREB1-Proteinmenge und die BDNF-Expression in der fluoridexponierten Gruppe synchron abnahmen, während Protein-Protein-Interaktionsanalysen eine funktionelle Assoziation zwischen CREB1 und BDNF nahelegten. Basierend auf diesen Daten vermuten wir, dass miR-23b-5p durch Beeinflussung des CREB1/BDNF-Signalwegs an fluoridbedingten neurologischen Schäden beteiligt sein könnte. Dies bietet einen wichtigen Ansatzpunkt für weiterführende mechanistische Studien. Die regulatorischen Beziehungen wurden in dieser Studie jedoch nicht durch Genüberexpression oder -knockdown bestätigt. Aufgrund der hohen Stabilität und Nachweisempfindlichkeit von miRNAs in Körperflüssigkeiten sowie des spezifischen Zusammenhangs von miR-23b-5p mit neurologischen Schäden schlagen wir miR-23b-5p als neuen molekularen Marker zur Beurteilung der Fluorid-Neurotoxizität vor. Dies könnte die frühzeitige Identifizierung von Risikogruppen erleichtern und neue Ansatzpunkte für die Entwicklung von Interventionsstrategien liefern.

Diese Studie wies folgende Einschränkungen auf: Erstens wurden ausschließlich männliche Ratten in das Experiment einbezogen. Dies geschah nicht nur aus wirtschaftlichen Gründen, sondern auch, um die Homogenität und Reproduzierbarkeit der Daten zu verbessern, da männliche Ratten im Allgemeinen eine stabilere Fluorid-Pharmakokinetik und neurotoxische Reaktionen zeigten. Die Bedeutung der Geschlechtsunterschiede war jedoch unbestreitbar. Bestehende Studien bestätigten, dass Östrogen die Expressionsregulation von miRNAs über Kernrezeptoren (z. B. ER) vermitteln kann.a, ERB) (Klinge, 2020Beispielsweise könnte es die miR-200-Familie hochregulieren, um neuroinflammatorische Reaktionen zu hemmen (Márton et al., 2020oder die Expression von Genen, die mit der Differenzierung von Neuronen zusammenhängen, über miR-124 zu regulieren (Varshney et al., 2017Zukünftige Studien könnten weibliche Ratten einbeziehen, um die geschlechtsspezifischen Regulationsmechanismen, die fluoridinduzierten neurologischen Schäden zugrunde liegen, umfassender aufzudecken. Zweitens wurden zwar mittels Durchflusszytometrie Trends in den Zellapoptoseraten ermittelt, quantitative Techniken wie die TUNEL-Färbung jedoch nicht zur Einzelzelllokalisierung und -zählung eingesetzt. Diese Einschränkung ergibt sich aus dem anfänglichen Fokus der Forschung auf das Screening molekularer Marker, wobei die Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie für eine schnelle Datenerfassung priorisiert wurde. Die TUNEL-Färbung erfordert hingegen eine längere Bearbeitungszeit und liefert daher keine direkten morphologischen Belege für den Zusammenhang zwischen Fluoridexposition und neuronaler Apoptose. Darüber hinaus untersuchte die Analyse der menschlichen Population lediglich die Korrelation zwischen Fluoridkonzentrationen im Urin und Biomarkern (z. B. miR-23b-5p, BDNF), ohne standardisierte kognitive Funktionstests (z. B. MMSE, MoCA) durchzuführen. Dies ist hauptsächlich auf begrenzte Ressourcen in der Querschnittsstudie und die Schwierigkeit zurückzuführen, groß angelegte Tests innerhalb kurzer Zeit durchzuführen. Da kognitive Funktionsbeurteilungen maßgeblich vom Bildungsniveau und der Mitarbeit der Teilnehmenden beeinflusst werden, priorisierte das Forschungsteam objektive biologische Probenanalysen als primären Endpunkt. Dies führte zu unzureichenden Belegen für einen Zusammenhang zwischen Fluoridexposition und neurologischen Schäden beim Menschen. In den In-vitro-Experimenten wurde lediglich eine Einzeldosis (30 mg/L NaF) verwendet, und die nachgeschalteten regulatorischen Signalwege von miR-23b-5p (z. B. die CREB1/BDNF-Signalachse) wurden nicht untersucht. Zukünftige Studien zielen darauf ab, die Mechanismen durch Mehrfachdosierung und die Identifizierung nachgeschalteter Zielstrukturen genauer zu erforschen.

Zusammenfassend zeigte diese Studie die zentrale regulatorische Rolle von miR-23b-5p bei fluoridinduzierten neurologischen Schäden. Experimentelle Ergebnisse belegten, dass Fluoridexposition die Expression von miR-23b-5p signifikant erhöhte, während gleichzeitig die BDNF-Expression verringert wurde. Der signifikante vermittelnde Effekt von miR-23b-5p zwischen Fluoridexposition und neurologischen Schäden wurde auf Populationsebene bestätigt. Dieser Befund liefert wichtige epidemiologische Belege für die Etablierung von miR-23b-5p als neuem Biomarker für fluoridinduzierte neurologische Schäden. Fluoridinduzierte neurologische Schäden sind ein komplexer Prozess, an dem mehrere Signalwege beteiligt sind. Neben der in dieser Studie aufgezeigten miR-23b-5p/BDNF-Achse bestätigten frühere Untersuchungen, dass Signalwege wie RhoA/ROCK (Chen et al., 2023) und oxidativer Stress/JNK (Liu et al., 2011Auch andere Faktoren spielten eine wichtige Rolle. Daher ist miR-23b-5p in diesem komplexen regulatorischen Netzwerk wahrscheinlich eher einer der Schlüsselfaktoren als der alleinige Faktor. Die potenziellen Wechselwirkungen zwischen miR-23b-5p und anderen Signalwegen stellen einen wichtigen Ansatzpunkt für zukünftige Forschung dar.

5. Fazit

Diese Studie zeigte, dass Fluoridexposition durch die Hochregulierung von miR-23b-5p zu fluoridbedingten neurologischen Schäden beiträgt. miR-23b-5p unterdrückt die BDNF-Expression und fördert die Apoptose. Diese Ergebnisse legen nahe, dass miR-23b-5p einer der wichtigsten regulatorischen Faktoren bei fluoridbedingten neurologischen Schäden ist und als potenzieller Biomarker dienen könnte. Da fluoridbedingte neurologische Schäden jedoch ein komplexes Signalnetzwerk involvieren, stellt miR-23b-5p wahrscheinlich nur eine kritische Komponente innerhalb dieses Netzwerks dar. Weitere Studien sind erforderlich, um zusätzliche regulatorische Faktoren zu untersuchen und die molekularen Mechanismen fluoridbedingter neurologischer Schäden vollständig aufzuklären. Diese Studie lieferte neue theoretische Erkenntnisse zu den pathogenen Mechanismen fluoridbedingter neurologischer Schäden und identifizierte potenzielle Zielstrukturen für präventive und therapeutische Strategien.

CRediT-Autorenbeitragserklärung

Wei Huang: Konzeptualisierung, Datenaufbereitung, Untersuchung, Formale Analyse, Methodik. Yunzhu Liu: Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überarbeitung und Redaktion. Shuaifei Yang: Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. Xirui Feng: Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. Jianguo Feng: Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. Yuting Jiang: Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. Yanhui Gao: Betreuung, Projektadministration, Mittelbeschaffung.