miR-23b-5p: Ein potenzieller Biomarker für fluoridbedingte neurologische Schäden.

Abstract

Die vollständige Online-Studie finden Sie auf ScienceDirect unter:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651325016161

Highlights

Fluoridexposition führte bei Ratten zu kognitiven Beeinträchtigungen und Gedächtnisstörungen durch Herabregulierung des Serum-BDNF-Spiegels.
miR-23b-5p könnte eine vermittelnde Rolle bei fluoridinduzierten Schäden an SH-SY5Y-Zellen spielen.
Es wird erwartet, dass miR-23b-5p ein potenzieller Biomarker für fluoridbedingte neurologische Schäden ist.

Neurologische Schäden durch Fluorid haben in den letzten Jahren große Aufmerksamkeit erregt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch weiterhin unklar, und es mangelt nach wie vor an effektiven Biomarkern für eine frühzeitige Diagnose. Um den molekularen Mechanismus der Fluorid-Neurotoxizität zu untersuchen und potenzielle Interventionsziele zu identifizieren, etablierten wir ein Rattenmodell mit Fluoridexposition sowie ein SH-SY5Y-Zellmodell. Wir stellten fest, dass 25, 50 und 100 mg/L NaF zu einer Beeinträchtigung des räumlichen Gedächtnisses, einer gestörten neuronalen Ausrichtung im Kortex und Hippocampus sowie zu reduzierten BDNF-Spiegeln im Kortex der Ratten führten. In-vitro-Experimente zeigten, dass Fluorid die Apoptose in SH-SY5Y-Zellen erhöhte. RNA-Sequenzierung ergab einen signifikanten Anstieg der miR-23b-5p-Spiegel im Hirngewebe fluoridexponierter Ratten. Weiterführende Validierungsexperimente bestätigten, dass Fluorid die miR-23b-5p-Expression sowohl im Rattenhirngewebe als auch in SH-SY5Y-Zellen hochreguliert. Die Hemmung von miR-23b-5p führte zu erhöhten BDNF-Proteinwerten (Brain-Derived Neurotrophic Factor) und reduzierter Apoptose in SH-SY5Y-Zellen. Dies deutet darauf hin, dass miR-23b-5p als wichtiger Regulator fluoridbedingter neurologischer Schäden fungiert. Um das Potenzial von miR-23b-5p als Biomarker für fluoridbedingte neurologische Schäden weiter zu untersuchen, führten wir eine epidemiologische Studie im Kreis Wenshui, Stadt Lüliang, Provinz Shanxi, China, durch. Die Ergebnisse zeigten, dass die miR-23b-5p-Expression im Blut mit steigender Fluoridkonzentration im Urin zunahm, während die BDNF-Expression im Serum mit steigender Fluoridkonzentration im Urin abnahm. miR-23b-5p wirkte teilweise vermittelnd zwischen Fluorid im Urin und BDNF. Diese Studie identifizierte einen neuen Biomarker und potenzielle Angriffspunkte für Interventionen bei fluoridbedingten neurologischen Schäden.

Grafische Zusammenfassung

Stichwörter
Fluorose
Neurologische Verletzung
MiR-23b-5p
Biomarker

AUSZÜGE:

1. Einleitung

Endemische Fluorose ist eine chronische systemische Erkrankung, die durch langfristige, übermäßige Fluoridexposition gekennzeichnet ist. Zu ihren typischen klinischen Symptomen zählen Zahnfluorose und Skelettfluorose. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt, dass weltweit über 200 Millionen Menschen von Trinkwasserfluorose bedroht sind, wobei bereits mehrere zehn Millionen klinische Symptome aufweisen ( Wang et al., 2023a ; Taher et al., 2024 ). Unter den verschiedenen klinischen Manifestationen ist die neurologische Schädigung besonders bedeutsam ( Scientific Reports, 2021 ; Lopes et al., 2020 ; Ren et al., 2022 ; Zhao et al., 2024 ; Wang et al., 2023b ). Sie äußert sich in kognitiven Beeinträchtigungen, Gedächtnisverlust und Aufmerksamkeitsstörungen ( Bashash et al., 2017 ; Retinasamy et al., 2019 ). Zunehmende Evidenz deutet darauf hin, dass Fluoridbelastung irreversible neurologische Schäden hervorruft, die zu einem reduzierten Intelligenzquotienten (IQ) bei Kindern und einem erhöhten Risiko für neurodegenerative Erkrankungen bei Erwachsenen beitragen ( Bashash et al., 2017 ). Diese Beeinträchtigungen mindern die Lebensqualität der Betroffenen erheblich und führen zu verzögerter Sprachentwicklung, Verlust der Arbeitsfähigkeit und Schwierigkeiten bei alltäglichen Aktivitäten ( Taylor et al., 2025 ; Adkins und Brunst, 2021 ; Valdez-Jiménez et al., 2011 ). Aufgrund des schleichenden Beginns werden dringend spezifische Biomarker für fluoridbedingte neurologische Schäden benötigt, um eine Früherkennung zu ermöglichen. Der derzeitige Mangel an solchen Biomarkern stellt jedoch eine erhebliche Herausforderung dar.

Frühere Studien untersuchten die Mechanismen fluoridinduzierter neurologischer Schäden ( Preston und Eichenbaum, 2013 ; Raud et al., 2023 ). Epidemiologisch wurde eine pränatale Fluoridexposition mit kognitiven Beeinträchtigungen der Nachkommen in Verbindung gebracht ( Bashash et al., 2017 ; Green et al., 2019 ). Tierstudien zeigten, dass Fluorid pathologische Veränderungen hervorruft, darunter neuronale Anomalien, reduzierte Zelldichte, apikale Dendritenatrophie und synaptische Diskonnektion ( Ning et al., 2021 ). In vitro induzierte Fluorid neurologische Schäden durch oxidativen Stress und die Dysregulation wichtiger Neuroschädigungsgene wie BDNF ( Ferreira et al., 2021 ). Mit fortschreitender Forschung wurden Biomarker für fluoridbedingte neurologische Schäden verfeinert: Synaptophysin und das postsynaptische Dichteprotein 95 (PSD-95) könnten als potenzielle Biomarker für synaptische Strukturschäden bei fluoridbedingten neurologischen Schäden dienen ( Li et al., 2022a ; Zhu et al., 2011 ; Yang et al., 2018 ), während das Tight-Junction-Protein ZO-1 eine Funktionsstörung der Blut-Hirn-Schranke im Kontext solcher neurologischer Schäden widerspiegeln könnte ( Xin et al., 2021 ). Die bisherige Forschung zu diesen Biomarkern beschränkte sich jedoch größtenteils auf Tiermodelle und In-vitro-Zellexperimente und wurde noch nicht systematisch an Populationen mit unterschiedlicher Fluoridbelastung validiert. Neuere epigenetische Forschung, insbesondere Erkenntnisse zur abnormalen Expression von microRNAs (miRNAs), lieferte neue Einblicke: miRNAs integrieren Schäden auf verschiedenen Ebenen und sind frühzeitig nachweisbar. Fluorid beeinträchtigte beispielsweise die neuronale Funktion durch Veränderung der miR-124-Methylierung und -Reifung ( Dar et al., 2019 ). Obwohl Fortschritte im Verständnis der Mechanismen der Fluorid-Neurotoxizität erzielt wurden, fehlten weiterhin spezifische Biomarker für das Bevölkerungsscreening oder die Früherkennung. Detaillierte Untersuchungen epigenetischer Marker, insbesondere miRNAs, und deren Zusammenhang mit der Fluorid-Neurotoxizität könnten die molekulare Risikobewertung und Strategien im Bereich der öffentlichen Gesundheit verbessern.

Eine wachsende Zahl von Studien belegt, dass miRNAs die Pathogenese der Fluorose regulieren. Als wichtige nicht-kodierende RNAs sind sie an verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. Epidemiologisch zeigen Fluorosepatienten abnorme Serum-miRNA-Spiegel, beispielsweise von miR-155, miR-21 und miR-146a. Tierstudien demonstrierten, dass die perinatale Fluoridexposition die Expression von miR-124 und miR-132 im Gehirn der Nachkommen erhöht und Lern- und Gedächtnisstörungen verursacht ( Wang et al., 2018 ). Zudem wurden 35 miRNAs in der Leber verändert ( Zhao et al., 2022 ). Unsere früheren Arbeiten identifizierten miR-200c-3p und miR-1213 als Bestandteile der fluoridinduzierten Skelettfluorose und kardiovaskulären Dysfunktion ( Pei et al., 2018 ; Jiang et al., 2018 ). Bislang waren jedoch nur wenige miRNAs bekannt, die mit fluoridbedingten neurologischen Schäden in Verbindung stehen, und es existierten keine spezifischen Biomarker für die Früherkennung und das Screening. Daher war eine umfassende Untersuchung der dynamischen miRNA-Expression bei dieser Schädigung unerlässlich – sie würde toxische Mechanismen aufklären, Zielstrukturen für eine miRNA-basierte, nicht-invasive Früherkennung liefern und die Früherkennung und präzise Prävention von Fluorose verbessern.

Als wichtige Regulatoren spielen miRNAs eine entscheidende Rolle bei neurologischen Schädigungen, und ihre Expressionsänderungen sind vielversprechende Biomarker. Bei der Alzheimer-Krankheit (AD) war miR-451a in der Zerebrospinalflüssigkeit reduziert und korrelierte positiv mit kognitiven Werten ( Feng et al., 2023 ). Bei der Parkinson-Krankheit wurden abnorme miR-7- und miR-153-Werte im peripheren Blut mit dem Krankheitsverlauf in Verbindung gebracht ( Benoit et al., 2020 ) – was miRNAs als potenzielle diagnostische Marker für neurologische Erkrankungen stützt. Frühere Studien zeigten neuroprotektive Effekte spezifischer miRNAs: miR-15a und miR-126 förderten die Gefäßregeneration und das neuronale Überleben in Schlaganfallmodellen ( Wu et al., 2017 ), während miR-122-5p strahleninduzierte neuronale Schäden durch die Unterdrückung neuroinflammatorischer Signalwege abmilderte ( Zhou et al., 2021 ). Bei Alzheimer war miR-23b-3p im Plasma herunterreguliert und korrelierte positiv mit kognitiven Werten, was auf einen diagnostischen Wert hindeutet. Möglicherweise könnte es durch die Hemmung von GSK-3B, also der Tau-Phosphorylierung und der neuronalen Apoptose, therapeutisch eingesetzt werden ( Jiang et al., 2022 ). Angesichts der Rolle von miRNAs bei neurologischen Schäden und ihrer peripheren Nachweisbarkeit würde die Untersuchung der Expression spezifischer miRNAs – wie beispielsweise miR-23b – bei fluoridinduzierten neurologischen Schäden toxische Mechanismen aufklären und die Grundlage für die Entwicklung blutbasierter miRNA-Nachweissysteme zur frühzeitigen Biomarkeridentifizierung schaffen.

Zusammenfassend zeigte diese Studie, dass Fluoridexposition neurologische Schäden induziert, sowohl in vivo als auch in vitro. RNA-Sequenzierung ergab eine signifikante Hochregulation von miR-23b-5p im zerebralen Kortex und Hippocampus fluoridexponierter Ratten, was in Tier- und Zellmodellen bestätigt wurde. Zelluläre Experimente bestätigten, dass miR-23b-5p die BDNF-Expression herunterreguliert und die Apoptose in SH-SY5Y-Zellen fördert. Populationsstudien zeigten, dass der miR-23b-5p-Spiegel im Blut mit steigender Fluoridkonzentration im Urin zunimmt, während die BDNF-Expression im Serum mit steigender Fluoridkonzentration im Urin abnimmt. miR-23b-5p spielt eine teilweise vermittelnde Rolle im Zusammenhang zwischen Fluoridkonzentration im Urin und Serum-BDNF, was auf sein Potenzial als latenter Frühmarker für fluorideinduzierte neurologische Schäden hindeutet.

… 2.14. Stichprobenziehung und Testung der Umfrageteilnehmer

Diese Studie wurde in drei Dörfern im Kreis Wenshui, Stadt Lüliang, Provinz Shanxi, durchgeführt, in denen Trinkwasserfluorose endemisch ist. Einschlusskriterien waren: ständige Einwohner über 18 Jahre, die seit mehr als fünf Jahren vor Ort leben, hauptsächlich lokale Wasserquellen nutzen und keine schwerwiegenden chronischen Erkrankungen aufweisen. Ausgeschlossen wurden Personen mit fehlenden Proben, Personen, die kürzlich fluoridhaltige Medikamente oder Antioxidantien eingenommen hatten, Schwangere und Stillende, Personen mit neurologischen Operationen oder Strahlentherapie in der Vorgeschichte sowie Personen mit anderen instabilen medizinischen Zuständen. Der Fragebogen umfasste hauptsächlich Basisdaten (Alter, Geschlecht, ethnische Zugehörigkeit), soziale Merkmale (Bildungsniveau) und Lebensgewohnheiten (Rauchen, Alkoholkonsum). Die körperliche Untersuchung umfasste unter anderem Größe, Gewicht und Taillenumfang. Aus 573 Teilnehmern des Screenings wurden 200 Probanden zufällig ausgewählt. Nach Ausschluss von Ausreißern und fehlenden Daten wurden schließlich 140 Probanden in die Analyse einbezogen. Von allen Probanden wurden Morgenurinproben im nüchternen Zustand zur Bestimmung der Fluoridkonzentration im Urin gesammelt. Von jedem Probanden wurden 5 ml venöses Nüchternblut entnommen und sofort in ein EDTA-haltiges Vakuumblutentnahmeröhrchen überführt. Dieses wurde vorsichtig geschwenkt und gemischt, um die Blutgerinnung zu verhindern. Nach dem Stehenlassen und Zentrifugieren wurden die entstandenen Blutgerinnsel gesammelt und bei -80 °C für die spätere Bestimmung des miR-23b-5p-Gehalts gelagert. Vor der Bestimmung wurden die gefrorenen Blutgerinnsel entnommen, mit einer sterilen Schere zerkleinert, mit 1 ml TRIzol-Reagenz (Invitrogen, USA) versetzt und in einem Eisbad mit einem Gewebehomogenisator homogenisiert, bis keine sichtbaren Klumpen mehr vorhanden waren. Die Gesamt-RNA wurde gemäß Standardprotokoll extrahiert und miR-23b-5p anschließend mittels quantitativer Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qPCR) mit Stamm-Schleifen-Sequenzierung (ABI, USA) nachgewiesen. Neuroinjuvenile Proteine wurden mittels Multiplex-Assay (Luminex Corporation, USA) analysiert. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission des Chinesischen Zentrums für Krankheitskontrolle und -prävention genehmigt (Genehmigungsnummer: HRBMUECDC20210410), und von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

… 3. Ergebnis

3.1. Allgemeiner Zustand von fluoridexponierten Ratten und Fluoridgehalt in Urin, Blut und Hirngewebe

Die Ergebnisse zeigten, dass das Körpergewicht der fluoridexponierten Ratten im Vergleich zur Kontrollgruppe dosisabhängig abnahm ( p < 0.01, Abb. 1A ), während das Verhältnis von Gehirn- zu Körpergewicht mit steigender Fluoridkonzentration zunahm ( p < 0.01, Abb. 1B ). Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die hemmende Wirkung von Fluorid auf das Gesamtwachstum deutlich stärker war als seine Wirkung auf das Gehirn. Selbst bei einer leichten Abnahme des Gehirngewichts würde dessen Anteil am Körpergewicht daher dennoch steigen. Zur Beurteilung der Fluoridbelastung untersuchten wir Fluorid im Urin, Serum und Gehirn sowie die Zahnfluorose bei Ratten. Wie in Abb. 1C –E dargestellt, waren die Fluoridkonzentrationen im Urin, Serum und Gehirn nach 12 Wochen freier Wasseraufnahme bei den Ratten höher als in der Kontrollgruppe ( p < 0.05). Die Zähne der Ratten in der Kontrollgruppe waren durchscheinend und glänzend. Im Gegensatz dazu entwickelten Ratten, die 25 mg/L NaF ausgesetzt waren, nur wenige weiße Beläge auf der Zahnoberfläche. Bei Ratten, die 50 mg/L bzw. 100 mg/L NaF ausgesetzt waren, zeigten die Zähne horizontale Streifen mit unterschiedlich starker gelblicher und weißer Verfärbung, begleitet von verminderter Transparenz und deutlichen Schäden an der Zahnstruktur ( Abb. 1F ). Die Ergebnisse belegen, dass das Fluorid-exponierte Rattenmodell erfolgreich etabliert wurde.

3.2. Fluoridbelastung führte bei Ratten zu Hirngewebeschäden.Um die Auswirkungen von Fluorid auf Hirnschäden zu untersuchen, wurde der Morris-Wasserlabyrinth-Test (MWM) eingesetzt, um die räumlichen Lern- und Gedächtnisfähigkeiten von Ratten zu beurteilen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Latenzzeit bis zum Auffinden der Plattform in der fluoridexponierten Gruppe signifikant länger war als in der Kontrollgruppe.p<0.01, Abb. 2A). Nach Entfernung der Plattform war die Häufigkeit des Überquerens des Zielquadranten in der fluoridexponierten Gruppe signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe (p<0.01, Abb. 2B) Die Ergebnisse des täglichen Trainings zeigten, dass die durchschnittliche Latenzzeit der Ratten in der Fluorid-exponierten Gruppe jeden Tag signifikant länger war als in der Kontrollgruppe.Abb. 2C). Die Schwimmwege der fluoridexponierten Gruppe waren im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe stärker gestreut und unorganisiert (Abb. 2D) Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Fluoridexposition das räumliche Lern- und Erinnerungsvermögen bei Ratten beeinträchtigte.

Um die durch Fluoridexposition verursachten neurologischen Schäden eingehend zu untersuchen, wurden in dieser Studie histopathologische Veränderungen im Rattenhirngewebe systematisch beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellen in der Kontrollgruppe geordnet angeordnet waren und eine einheitliche Zytoplasmafärbung aufwiesen. In der 25-mg/L-Gruppe waren die Strukturen des Großhirns und des Hippocampus der Ratten klar erkennbar und wiesen keine offensichtlichen strukturellen Schäden auf. In den Gruppen mit 50 mg/L und 100 mg/L zeigten die Zellkörper im Großhirn der Ratten hingegen eine signifikante Schrumpfung mit verschwommener Gewebeschichtung und ungeordneter Zellanordnung. Zusätzlich war eine große Anzahl von Pyramidenzellen in der Hippocampusregion reduziert, und die Zellkörper waren fragmentiert und wiesen Vakuolenbildung auf ( Abb. 2E ). Die Nissl-Färbung zeigte, dass die Neuronen in der CA1-Region des Hippocampus der Kontrollgruppe intakt, dicht angeordnet und reich an Nissl-Körperchen waren, während die Hochdosisgruppe eine signifikante Reduktion der Neuronenzahl und eine lockere Anordnung aufwies ( Abb. 2F ). Die quantitative Analyse ergab eine signifikant niedrigere neuronale Dichte in den fluoridexponierten Gruppen ( p < 0.001), die mit zunehmender Fluoridbelastung dosisabhängig abnahm ( Abb. 2G ). Elektronenmikroskopisch zeigten sich in der 25-mg/L-Gruppe mitochondriale Schwellungen und eine Fragmentierung der mitochondrialen Cristae. In der 50-mg/L-Gruppe wurden in den Neuronen eine Fragmentierung der mitochondrialen Cristae und ein teilweiser Verlust der Doppelschichtstruktur der Kernhülle beobachtet. In der 100-mg/L-Gruppe kam es zu einer Chromatinmarginalisierung; zudem wiesen die Mikrotubuli eine geringe Kontinuität mit starken Brüchen und eine lockere Gewebestruktur auf, begleitet von zytoplasmatischen Vakuolen und einer Fragmentierung oder dem Verschwinden der mitochondrialen Cristae ( Abb. 2H ). Anschließend wurde der BDNF-Proteinspiegel, ein Schlüsselfaktor für Hirnschädigungen im Rattenhirnrinde, bestimmt ( Abb. 2I , J). Die Ergebnisse zeigten, dass der BDNF-Proteinspiegel in der 100 mg/L NaF-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant reduziert war ( p < 0.001). Die obigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fluoridexposition zu dosisabhängigen neurologischen Schäden führen kann, deren Ausmaß eng mit der Expositionsdosis zusammenhängt.

3.3. Fluoridexposition induzierte Schädigung von SH-SY5Y-Zellen.Auf Grundlage des RTCA-Tests wurde ermittelt, dass 30 mg/L NaF für die Konstruktion des Fluor-induzierten SH-SY5Y-Zellschädigungsmodells verwendet werden sollten.Abb. 3A) Bei dieser Dosis war die Aktivität der SH-SY5Y-Zellen signifikant niedriger als die der Kontrollgruppe und lag im sicheren Überlebensbereich (Aktivität > IC<sub>50</sub>).₅₀), wodurch der Zellzustand für die nachfolgende Detektion sichergestellt und eine Schädigung der SH-SY5Y-Zellen induziert werden könnte. Die weitere Untersuchung der BDNF-Proteinspiegel in SH-SY5Y-Zellen zeigte, dass die BDNF-Proteinexpression in der 30 mg/L NaF-Gruppe signifikant niedriger war als in der Kontrollgruppe (p<0.05, Abb. 3B, C).

Die Auswirkungen einer Fluoridbelastung auf die Apoptose von SH-SY5Y-Zellen sind in Abb. 3 D-G dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass 30 mg/L NaF die Apoptose von SH-SY5Y-Zellen signifikant auf das 2.31-Fache der Kontrollgruppe erhöhte ( p < 0.01). Diese Daten bestätigen die schädliche Wirkung einer Fluoridbelastung auf SH-SY5Y-Zellen.

3.4. RNA-Sequenzierung ergab, dass Fluorid die miR-23b-5p-Expression im Hirngewebe von fluoridexponierten Ratten erhöhte.Die miRNA-Expressionsprofile von Hirngewebe fluoridexponierter und Kontrollratten wurden mittels Hochdurchsatzsequenzierung analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass 40 differentiell exprimierte miRNAs im zerebralen Kortex identifiziert wurden (19 hochreguliert und 21 herunterreguliert). Abb. 4A) und 33 unterschiedlich exprimierte miRNAs wurden im Hippocampus nachgewiesen (16 hochreguliert und 17 herunterreguliert, Abb. 4B). Die Heatmap-Analyse ergab spezifische Expressionsmuster dieser miRNAs (Abb. 4Neun differentiell exprimierte miRNAs wurden sowohl im zerebralen Kortex als auch im Hippocampus gefunden, was auf deren mögliche Beteiligung an den gemeinsamen Regulationsmechanismen der Fluorid-Neurotoxizität hindeutet. Unter ihnen zeigte miR-23b-5p die signifikanteste Expressionsänderung und wird als zentrales regulatorisches Molekül vermutet, das fluoridinduzierte neurologische Schäden vermittelt. Abb. 4

Abb. 4. RNA-Sequenzierung zeigte, dass Fluorid die miR-23b-5p-Expression im Hirngewebe fluoridexponierter Ratten erhöhte. (A) Vulkan-Diagramm der differentiell exprimierten miRNAs im Kortex. (B) Vulkan-Diagramm der differentiell exprimierten miRNAs im Hippocampus. (C) Heatmap der differentiell exprimierten miRNAs im Kortex. (D) Heatmap der differentiell exprimierten miRNAs im Hippocampus. n = 3.

3.5. Funktionelle Anreicherung von GO und KEGG für Zielgene differentiell exprimierter miRNAs

Um die potenziellen regulatorischen Funktionen der differentiell exprimierten miRNAs weiter zu untersuchen, wurden GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen der Zielgene der differentiell exprimierten miRNAs im Hirngewebe von fluoridexponierten Ratten und Kontrollratten durchgeführt. Die GO-Funktionen der Zielgene der differentiell exprimierten miRNAs im zerebralen Kortex waren signifikant in „zelluläre Reaktion auf UV-C“ und „Transläsionssynthese“ angereichert.Abb. 5A), und ihre KEGG-Signalwege waren signifikant angereichert im „Fanconi-Anämie-Signalweg“ und im „Fc epsilon RI-Signalweg“ (Abb. 5C). Die GO-Funktionen der Zielgene differentieller miRNAs im Hippocampus waren signifikant angereichert in „Replikation einzelsträngiger viraler RNA über ein doppelsträngiges DNA-Intermediat“ und „Regulation der Glykogen-(Stärke-)Synthase-Aktivität“ (Abb. 5B) und ihre KEGG-Signalwege waren signifikant angereichert in „Adipokin-Signalweg“ und „Kontraktion der glatten Gefäßmuskulatur“ (Abb. 5D). Abb. 5

Abb. 5. GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen von Zielgenen differentiell exprimierter miRNAs in Ratten. (A) GO-Anreicherungsdiagramm der Zielgene differentiell exprimierter miRNAs im zerebralen Kortex. (B) GO-Anreicherungsdiagramm der Zielgene differentiell exprimierter miRNAs im Hippocampus. (C) KEGG-Stoffwechselwegkarte der Zielgene differentiell exprimierter miRNAs im zerebralen Kortex. (D) KEGG-Stoffwechselwegkarte der Zielgene differentiell exprimierter miRNAs im Hippocampus.

3.6. Fluoridexposition erhöhte die miR-23b-5p-Expression in Rattenhirngewebe und SH-SY5Y-Zellen.

Zur Überprüfung der RNA-Sequenzierungsergebnisse wurde die miR-23b-5p-Expression in Rattenhirngewebe und SH-SY5Y-Zellen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die miR-23b-5p-Expression im zerebralen Kortex und im Hippocampusgewebe der 50- und 100-mg/L-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht war.p<0.01, Abb. 6AB).

In SH-SY5Y-Zellen war der miR-23b-5p-Expressionsspiegel nach Behandlung mit 30 mg/L NaF im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht ( p < 0.001, Abb. 6C ). Die Ergebnisse der Tier- und Zellmodelle stimmten überein und bestätigten, dass Fluoridexposition die miR-23b-5p-Expression hochreguliert.

3.7. miR-23b-5p vermittelte Fluorid-induzierte Apoptose in SH-SY5Y-Zellen

Um zu untersuchen, ob miR-23b-5p die Fluorid-induzierte Apoptose in SH-SY5Y-Zellen vermittelt, wurden funktionelle Validierungsexperimente durch Hemmung der miR-23b-5p-Expression durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Exposition gegenüber 30 mg/L NaF über 12 h die BDNF-Expression in SH-SY5Y-Zellen signifikant hemmte, während die Hemmung von miR-23b-5p die BDNF-Expression signifikant erhöhte ( p < 0.05). Der BDNF-Expressionsgrad in der Inhibitorgruppe war signifikant höher als in der Kontrollgruppe (p < 0.01, Abb. 7 A-B), was darauf hindeutet, dass die Hemmung von miR-23b-5p die BDNF-Expression in Abwesenheit von Fluorid effektiver fördern kann. Neuronale Apoptose-Assays zeigten, dass die NaF-Behandlung die Apoptose signifikant erhöhte ( p < 0.05, Abb. 7 C-F) und die Apoptose in der Inhibitorgruppe reduziert war ( p < 0.05). Die Apoptoserate in der Gruppe mit kombinierter Behandlung war signifikant niedriger als in der NaF-Gruppe ( p < 0.0001). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hemmung von miR-23b-5p die Fluorid-induzierte Apoptose in SH-SY5Y-Zellen teilweise rückgängig machen kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass miR-23b-5p die Fluorid-induzierte Apoptose in SH-SY5Y-Zellen vermitteln könnte.

Abb. 7

Abb. 7. miR-23b-5p-vermittelte Fluorid-induzierte Apoptose in SH-SY5Y-Zellen. (A) BDNF-Proteinexpression in SH-SY5Y-Zellen nach Transfektion mit einem miR-23b-5p-Inhibitor. (B) Quantifizierung der BDNF-Proteinexpression in SH-SY5Y-Zellen nach Transfektion mit einem miR-23b-5p-Inhibitor. (C) Apoptose von SH-SY5Y-Zellen nach Transfektion mit einem miR-23b-5p-Inhibitor. (D) Quantifizierung der frühen, späten und gesamten Apoptose in SH-SY5Y-Zellen nach Transfektion mit einem miR-23b-5p-Inhibitor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe. ### p < 0.001, #### p < 0.0001 im Vergleich zur NaF-Gruppe. ++ p <0.01 im Vergleich zur Inhibitorgruppe.

3.8. miR-23b-5p als potenzieller Biomarker für fluoridinduzierte neurologische Schäden in Populationen

In dieser Studie wurde die Fluoridkonzentration im Urin als Indikator zur Beurteilung der Fluoridbelastung herangezogen. Die Verteilung der Fluoridkonzentrationen im Urin der 140 Probanden war wie folgt: Der Median betrug 1.59 mg/L, der Interquartilsabstand (IQR) lag zwischen 0.93 mg/L und 2.08 mg/L. Zur Einteilung in drei Gruppen wurde die Studienpopulation anhand der Fluoridkonzentrationen im Urin mittels Terzilenverfahren in drei Gruppen unterteilt: Gruppe mit niedriger Belastung (UF < 0.93 mg/L, n = 47), Gruppe mit mittlerer Belastung (0.93 mg/L < UF < 2.08 mg/L, n = 47) und Gruppe mit hoher Belastung (UF > 2.08 mg/L, n = 46). Die mediane Fluoridkonzentration im Urin betrug in den einzelnen Gruppen 0.77 mg/L (Gruppe mit niedriger Fluoridkonzentration), 1.62 mg/L (Gruppe mit mittlerer Fluoridkonzentration) und 2.86 mg/L (Gruppe mit hoher Fluoridkonzentration). Die Unterschiede zwischen den Gruppen waren statistisch signifikant ( p < 0.001). Die Analyse der Ausgangsdaten zeigte keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den drei Studiengruppen hinsichtlich demografischer Merkmale und Gesundheitsindikatoren wie Alter, Geschlecht, Bildungsniveau, Raucheranamnese, Alkoholkonsum und Body-Mass-Index (BMI) ( p > 0.05). Dies deutet darauf hin, dass die Gruppen vergleichbar waren ( Tabelle 1 ).

Tabelle 1. Grundlegende Merkmale der Studienpopulation.

Leere Zelle	ALLER (n = 140)	Niedrige UF (n = 47)	Mittlere UF (n=47)	Hohe UF (n = 46)	p
Geschlecht					0.251
Männlich	50 (35.7%)	19 (40.4%)	19 (40.4%)	12 (26.1%)
Weiblich	90 (64.3%)	28 (59.6%)	28 (59.6%)	34 (73.9%)
Alter Jahre)	55.76 10.62 ±	55.32 10.82 ±	54.74 10.71 ±	57.26 10.39 ±	0.492
Fachwissen					0.379
Primarstufe und darunter	48 (34.3%)	20 (42.6%)	12 (25.5%)	16 (34.8%)
Mittelschule	81 (57.9%)	23 (48.9%)	30 (63.8%)	28 (60.9%)
Gymnasium und höher	11 (7.9%)	4 (8.5%)	5 (10.6%)	2 (4.3%)
Rauchen					0.574
Nein	116 (82.9%)	39 (83.0%)	37 (78.7%)	40 (87.0%)
Ja	24 (17.1%)	8 (17.0%)	10 (21.3%)	6 (13.0%)
Alkohol					0.079
Nein	111 (79.3%)	37 (78.7%)	33 (70.2%)	41 (89.1%)
Ja	29 (20.7%)	10 (21.3%)	14 (29.8%)	5 (10.9%)
BMI (kg / m²)	25.04 3.46 ±	24.85 3.20 ±	24.75 4.08 ±	25.52 3.04 ±	0.507
UF (mg/l)	1.59 (0.93,2.08)	0.77 (0.58,0.94)	1.62 (1.34,1.73)	2.86 (2.08,3.88)	<0.001

Die Ergebnisse der Mediationsanalyse (Abb. 8) zeigten, dass die Fluoridkonzentration im Urin einen signifikanten positiven Effekt auf miR-23b-5p hatte (a=1.28, p<0.001), während miR-23b-5p einen signifikanten negativen Effekt auf BDNF ausübte (b=-1099, p<0.05). Weitere Analysen ergaben, dass die direkte hemmende Wirkung von Fluorid im Urin auf BDNF c' = -1581.9 betrug (p<0.05), und der Gesamteffekt einschließlich der vermittelnden Rolle betrug c = -2992.1 (p<0.001). Unter diesen war der indirekte Effekt, der durch miR-23b-5p vermittelt wird (ab=-1410, pDer p-Wert (p < 0.05) trug zu 47.1 % zum Gesamteffekt bei. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fluoridexposition nicht nur die BDNF-Expression direkt hemmt, sondern auch den BDNF-Abfall durch Hochregulierung von miR-23b-5p verstärkt. Dies legt nahe, dass miR-23b-5p als wichtiger Mediator im Zusammenhang zwischen Fluoridexposition und Markern neurologischer Schädigung fungiert. Sein Wert als potenzieller Biomarker verdient daher Beachtung.

4. Diskussion

Die Früherkennung und die mechanistische Analyse fluoridbedingter neurologischer Schäden haben sich zu internationalen Forschungsschwerpunkten entwickelt. Epidemiologische Studien belegen, dass eine langfristige Fluoridexposition signifikant mit kognitiven Beeinträchtigungen, Gedächtnisverlust und einem erhöhten Risiko für neurodegenerative Erkrankungen einhergeht ( Russ et al., 2020 ; Li et al., 2016 ; NTP-Monographie, 2024 ). Aufgrund der Latenz und Irreversibilität neurologischer Schäden stellen Früherkennung und Intervention erhebliche Herausforderungen dar. Daher ist die Suche nach hochsensitiven und spezifischen Biomarkern von großer Bedeutung für die Früherkennung und die mechanistische Erforschung fluoridbedingter neurologischer Schäden. Diese Studie, die sich auf das Screening von Biomarkern für fluoridbedingte neurologische Schäden konzentriert, bestätigte durch multidimensionale Untersuchungen, dass miR-23b-5p als potenzieller Biomarker für diese Schäden dienen könnte. Diese Studie lieferte wichtige theoretische Belege für die Früherkennung von Fluorose, die Formulierung von Präventionsstrategien und das Screening präziser Interventionsziele und bot neue Ansätze sowie eine solide wissenschaftliche Grundlage für die Prävention und Behandlung von durch Fluorid verursachten neurologischen Schäden.

Die durch Fluorid verursachten neurologischen Schäden wurden in verschiedenen Forschungsarbeiten bestätigt. Epidemiologische Untersuchungen zeigten einen negativen Zusammenhang zwischen Fluoridbelastung und kognitiven Beeinträchtigungen ( Grandjean und Landrigan, 2014 ). Langfristiger Konsum von fluoridreichem Wasser führte zu signifikant reduzierten IQ-Werten bei Kindern, und es bestand eine Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen der Fluoridkonzentration im Urin und kognitiven Funktionsstörungen ( Choi et al., 2015 ). In Tierversuchen stimmten die Ergebnisse unserer Studie weitgehend mit denen von Rocha-Amador et al. ( Rocha-Amador et al., 2007 ) überein: Morris-Wasserlabyrinth-Tests (MWM) zeigten bei fluoridexponierten Ratten eine verlängerte Fluchtlatenz und weniger Plattformüberquerungen, was mit den von Valdez-Jiménez et al. ( Valdez-Jiménez et al., 2011 ) berichteten Defiziten im räumlichen Lernen und Gedächtnis übereinstimmt. Histopathologische Untersuchungen zeigten eine desorganisierte Neuronenanordnung und eine reduzierte Anzahl von Nissl-Körperchen in der CA1-Region des Hippocampus von fluoridexponierten Ratten. Elektronenmikroskopische Untersuchungen deckten ultrastrukturelle Veränderungen wie mitochondriale Schwellungen und Cristae-Fragmentierung in den Neuronen auf. In-vitro-Experimente ergaben, dass die Exposition von SH-SY5Y-Zellen gegenüber 30 mg/L NaF über 12 Stunden zu einem Anstieg der Apoptoserate führte. Dies deckt sich mit den von Ke et al. und Zhou et al. ( Ke et al., 2016; Zhou et al., 2019 ) berichteten Ergebnissen zur fluorinduzierten neuronalen Apoptose. Zusammenfassend deuten diese Befunde darauf hin, dass Fluoridexposition kognitive und neurologische Schäden bei Ratten verursacht.

In dieser In-vivo-Studie verwendeten wir drei NaF-Expositionsdosen: 25, 50 und 100 mg/L. Nach der Umrechnung betrugen die entsprechenden humanen Äquivalenzdosen etwa 3.9, 7.9 bzw. 15.8 mg/L. Die WHO empfiehlt einen Grenzwert von 1.5 mg/L für die Fluoridkonzentration im Trinkwasser. In einigen Gebieten mit hoher Fluoridbelastung können die Fluoridwerte im Trinkwasser jedoch bis zu 20 mg/L erreichen und damit den WHO-Richtwert deutlich überschreiten. Daher war die Verwendung dieser Dosen für die Untersuchung der gesundheitlichen Auswirkungen einer hohen Fluoridbelastung gerechtfertigt. Darüber hinaus wurde das Drei-Dosen-Design angewendet, um die minimale effektive Dosis zu bestimmen, die erforderlich ist, um neuronale Schäden hervorzurufen und die miR-23b-5p-Expression zu verändern, um zu beobachten, ob sich die Effekte mit steigender Dosis verstärken, und um sicherzustellen, dass die Dosis von 100 mg/L typische neuropathologische Phänotypen im Zusammenhang mit Fluorose innerhalb eines relativ kurzen Versuchszeitraums zuverlässig reproduzieren kann. Die Gründe für die Festlegung der Fluoridexpositionsdauer auf 12 Wochen in dieser Studie sind folgende: Ein Zeitraum von 12 Wochen (3 Monaten) gilt in der toxikologischen Forschung allgemein als subchronische Expositionsdauer. Sein Hauptvorteil liegt in der Fähigkeit, typische pathologische Phänotypen der Fluoridtoxizität bei Ratten stabil hervorzurufen. Bisherige Studien haben gezeigt, dass eine Fluoridexposition von 3 oder 6 Monaten bei Ratten Schäden wie erhöhte Fluoridkonzentrationen im Urin, deutliche Zahnfluorose und kognitive Dysfunktion verursachen kann ( Wang et al., 2023b ; Dong et al., 2024 ). Aus wirtschaftlicher Sicht kann eine Expositionsdauer von 12 Wochen die Kosten für die Tierfütterung deutlich reduzieren und den Versuchszyklus verkürzen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Wahl einer 12-wöchigen Fluoridexpositionsdauer in dieser Studie nicht nur den klassischen Designstandards für subchronische Toxizitätsmodelle entspricht, sondern auch die Durchführbarkeit und Wirtschaftlichkeit des Experiments in Einklang bringt und somit eine stabile Modellgrundlage für nachfolgende Untersuchungen der mit der Fluoridexposition verbundenen toxischen Mechanismen bietet. Die Fluoridkonzentration im Urin ist ein zentraler Indikator für die interne Fluoridexposition. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die Fluoridkonzentration im Urin von Ratten mit höheren Expositionsdosen anstieg, was die erfolgreiche Etablierung des Fluoridexpositionsdosismodells direkt bestätigte und eine Grundlage für weitere Forschung schuf. Dies unterscheidet sich jedoch von der tatsächlichen Situation einer langfristigen Exposition gegenüber niedrigen Fluoridkonzentrationen beim Menschen. Daher können in zukünftigen Studien Modelle mit niedrigeren Konzentrationen und längeren Expositionsdauern eingesetzt werden, um entsprechende Untersuchungen durchzuführen.

BDNF ist ein wichtiger molekularer Marker für neurologische Schädigungen ( Autry und Monteggia, 2012 ). Klinische Studien zeigten, dass die Serum-BDNF-Konzentration bei Alzheimer-Patienten negativ mit dem Schweregrad der Erkrankung korrelierte ( Laske et al., 2007 ), chronischer Stress zu einer anhaltenden Herabregulierung der BDNF-Expression im Hippocampus führte ( Duman und Monteggia, 2006 ) und verschiedene Neurotoxine BDNF-Expressionsanomalien induzierten, die den klinischen Symptomen vorausgingen. In dieser Studie wurde festgestellt, dass Fluoridexposition die BDNF-Konzentration sowohl im zerebralen Kortex als auch in SH-SY5Y-Zellen senkte. Die Populationsanalyse ergab eine negative Korrelation zwischen Fluorid im Urin und BDNF, was mit früheren Befunden übereinstimmt und die universelle Anwendbarkeit von BDNF als Marker für neurologische Schädigungen bestätigt. Bisherige Forschungsergebnisse zeigten, dass eine subchronische Fluoridexposition die BDNF-Protein-Expression im Hippocampus von Ratten um 40 % reduzierte, begleitet von einer Beeinträchtigung des räumlichen Gedächtnisses ( Niu et al., 2009 ), was mit den Ergebnissen dieser Studie übereinstimmt. Frühere Untersuchungen wiesen darauf hin, dass fluoridinduzierte neurologische Schäden auch Veränderungen in einer Reihe anderer Indikatoren hervorrufen können, darunter Indikatoren für oxidativen Stress (z. B. ROS, MDA, SOD) ( Barbier et al., 2010 ), Entzündungszytokine (TNF- α , IL-6 usw.) ( Fu et al., 2022 ), Proteine der synaptischen Plastizität (PSD-95 usw.) ( Zhu et al., 2011 ) und Apoptose-assoziierte Proteine. In dieser Studie wurde BDNF als Markerprotein für neurologische Schäden ausgewählt, da es als zentraler Regulator des neuronalen Überlebens und der synaptischen Plastizität direkt mit der kognitiven Funktion zusammenhängt und da periphere BDNF-Spiegel neurologische Schäden widerspiegeln können. Es ist anzumerken, dass BDNF zwar Vorteile als Marker bietet, neurologische Schädigungen jedoch synergistische Wechselwirkungen innerhalb multimolekularer Netzwerke beinhalten. Zukünftige Studien könnten weitere mit neurologischen Schädigungen in Zusammenhang stehende Moleküle (z. B. NGF, NT-3, Indikatoren für oxidativen Stress und Entzündungen) in gemeinsamen Tests einbeziehen, um ein umfassenderes Bewertungssystem für fluoridinduzierte neurologische Schädigungen zu entwickeln.

In den letzten Jahren wurden Fortschritte in der Fluoridforschung und ihren Auswirkungen auf das Nervensystem erzielt. Dabei werden verschiedene Biomarker zur Beurteilung fluoridbedingter neurologischer Schäden eingesetzt. Traditionelle Studien konzentrierten sich auf Marker für oxidativen Stress (z. B. ROS, MDA) und Entzündungsfaktoren (z. B. TNF-α).aIL-6), die zwar auf zelluläre Schäden durch Fluoridexposition hinweisen, weisen jedoch keine Gewebespezifität auf und treten erst spät im Verlauf der Erkrankung auf. Mit der Vertiefung der epigenetischen Forschung haben sich microRNAs als neuartige Biomarker mit Vorteilen herausgestellt, und ihre Zusammenhänge mit neurologischen Erkrankungen wurden vielfach beschrieben (Chandran et al., 2024, Banack et al., 2024Beispielsweise ist das Serum-miR-124-3p bei Parkinson-Patienten herunterreguliert (Esteves et al., 2022), miR-155 moduliert die Mikroglia-Funktion über IFN-y Signalgebung zur Verbesserung der Kognition bei Alzheimer (Yinet al., 2023), und miR-29c-3p wurde auch mit der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht (Sha et al., 2021Insbesondere in Modellen neurologischer Verletzungen korrelierten Veränderungen der miR-23b-Expression eng mit dem Fortschreiten der Nervenverletzung. Studien zeigten, dass miR-23b GnT-III als Zielstruktur haben und den Akt/GSK-3-Signalweg aktivieren kann.B Signalweg zur Hemmung der Tau-Protein-Pathologie und veränderte die Verarbeitung des Amyloid-Vorläuferproteins (ABPP), um oxidativen Stress zu unterdrücken und dadurch kognitive Beeinträchtigungen und pathologische Symptome im Zusammenhang mit Alzheimer zu verbessern (Pan et al., 2021In einem Rattenmodell für zerebrale Ischämie-Reperfusion-induzierte neurologische Schäden war die miR-23b-Expression herunterreguliert und förderte die Apoptose von Hippocampusneuronen durch die Regulierung des TAB3/NF-Signalwegs._kB/p53-Achse (Roshan-Milani et al., 2022); Schwann-Zellen, die mechanischer Stimulation ausgesetzt sind, geben miR-23b-3p über ihre extrazellulären Vesikel an Neuronen ab, wodurch die Expression von Neuropilin 1 (Nrp1) in Neuronen herunterreguliert und die axonale Regeneration gefördert wird (Xia et al., 2020Diese Studie identifizierte eine entscheidende Rolle von miR-23b-5p bei fluoridinduzierten neurologischen Schäden: Seine Expression war sowohl in Tiermodellen als auch in SH-SY5Y-Zellmodellen nach Fluoridexposition signifikant erhöht. Eine wichtige Folgefrage lautet: Wie reguliert Fluorid die Expression von miR-23b-5p? Obwohl diese Studie die vorgelagerten Mechanismen nicht direkt untersuchte, schlagen wir basierend auf den bekannten toxikologischen Wirkungen von Fluorid und den regulatorischen Eigenschaften von miR-23b-5p mehrere plausible Möglichkeiten zur Validierung in zukünftigen Studien vor. Erstens ist oxidativer Stress wahrscheinlich ein wichtiger vorgelagerter Faktor. Zahlreiche Studien haben bestätigt, dass Fluoridexposition rasch einen starken Anstieg des intrazellulären Gehalts an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) induziert.Li et al., 2024ROS wirken nicht nur als Effektormoleküle, sondern auch als wichtige Signalmoleküle, die Transkriptionsfaktoren wie NF-κB aktivieren können._kB und p53 (Li et al., 2022b, Zhang et al. 2025Diese Transkriptionsfaktoren können direkt an die Promotorregion von miR-23b-5p binden und dessen Transkription steuern. Zweitens könnte Neuroinflammation eine vermittelnde Rolle spielen. Fluorid kann Gliazellen aktivieren und dadurch die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine wie TNF-α auslösen.a und IL-1B (Wang et al., 2024Diese Entzündungsmediatoren können parakrin auf Neuronen wirken und die Expression von miR-23b-5p indirekt regulieren, indem sie deren Oberflächenrezeptoren (z. B. TNFR) aktivieren.Li et al., 2021) und nachgeschaltete Signalwege (Yang et al., 2022Darüber hinaus darf die epigenetische Reprogrammierung nicht außer Acht gelassen werden. Fluorid kann die Chromatinzugänglichkeit des miR-23b-5p-Genlocus durch Mechanismen wie die Regulierung der DNA-Methylierung oder Histonmodifikation verändern und dadurch die Hemmung seiner Transkription aufheben und seine Expression fördern (Yamashita et al., 2024, Dey Bhowmik et al., 2023In der Populationsanalyse spiegelte die negative Korrelation zwischen Fluoridkonzentration im Urin und BDNF nicht nur einen direkten inhibitorischen Effekt wider, sondern auch eine Verstärkung des BDNF-Abfalls durch Hochregulation von miR-23b-5p. Die Mediationsanalyse zeigte, dass etwa 47.1 % der fluoridinduzierten BDNF-Reduktion durch miR-23b-5p vermittelt wurden. Dieser Befund lieferte humane Evidenz für den Zusammenhang zwischen Fluoridexposition, Regulation nicht-kodierender RNA und neurologischer Schädigung und legt nahe, dass miR-23b-5p als potenzieller Biomarker für die Verbindung zwischen Fluoridexposition und neurologischer Schädigung dienen könnte. Obwohl in dieser Studie versucht wurde, Verzerrungen durch Störfaktoren mittels strenger Ein- und Ausschlusskriterien zu minimieren (z. B. Berücksichtigung der Wohndauer und Ausschluss schwerwiegender chronischer Erkrankungen), ist aufgrund des Beobachtungscharakters der Studie dennoch Vorsicht hinsichtlich des potenziellen Einflusses unkontrollierter Störfaktoren auf die Ergebnisse geboten. Im Hinblick auf die Ernährung können Mineralstoffe wie Kalzium und Magnesium die Fluoridbelastung im Körper verändern, indem sie die Fluoridaufnahme und den Fluoridstoffwechsel beeinflussen, während antioxidative Nährstoffe den durch Fluorid verursachten oxidativen Stress lindern können (Tao et al., 2022, Tefera et al., 2022Eine unzureichende Berücksichtigung von Ernährungsunterschieden könnte die Aussagekraft des Zusammenhangs zwischen Fluorid und miR-23b-5p beeinträchtigen. Auch Unterschiede im genetischen Hintergrund dürfen nicht außer Acht gelassen werden: Genetische Polymorphismen in Enzymen des Fluoridstoffwechsels (z. B. UGT, GST) und in den regulatorischen Regionen von miR-23b-5p können zu individuellen Unterschieden in den Reaktionen auf Fluoridexposition führen und somit die Interpretation der Ergebnisse beeinflussen.Er und andere, 2023Zukünftige Forschung sollte Biomarker-Profiling und Genomanalysen integrieren, um ernährungsbedingte und gleichzeitige Expositionsfaktoren präzise zu kontrollieren und die genetische Prädisposition aufzuklären. Dadurch könnten die kausalen Zusammenhänge und die individuelle Variabilität fluoridbedingter neurologischer Schäden verdeutlicht werden. Bioinformatische Analysen (TargetScan- und miRDB-Datenbanken) identifizierten potenzielle Bindungsstellen für miR-23b-5p am cAMP-Response-Rezeptor-bindenden Protein 1 (CREB1). Proteomische Analysen zeigten, dass die CREB1-Proteinmenge und die BDNF-Expression in der fluoridexponierten Gruppe synchron abnahmen, während Protein-Protein-Interaktionsanalysen eine funktionelle Assoziation zwischen CREB1 und BDNF nahelegten. Basierend auf diesen Daten vermuten wir, dass miR-23b-5p durch Beeinflussung des CREB1/BDNF-Signalwegs an fluoridbedingten neurologischen Schäden beteiligt sein könnte. Dies bietet einen wichtigen Ansatzpunkt für weiterführende mechanistische Studien. Die regulatorischen Beziehungen wurden in dieser Studie jedoch nicht durch Genüberexpression oder -knockdown bestätigt. Aufgrund der hohen Stabilität und Nachweisempfindlichkeit von miRNAs in Körperflüssigkeiten sowie des spezifischen Zusammenhangs von miR-23b-5p mit neurologischen Schäden schlagen wir miR-23b-5p als neuen molekularen Marker zur Beurteilung der Fluorid-Neurotoxizität vor. Dies könnte die frühzeitige Identifizierung von Risikogruppen erleichtern und neue Ansatzpunkte für die Entwicklung von Interventionsstrategien liefern.

Diese Studie wies folgende Einschränkungen auf: Erstens wurden ausschließlich männliche Ratten in das Experiment einbezogen. Dies geschah nicht nur aus wirtschaftlichen Gründen, sondern auch, um die Homogenität und Reproduzierbarkeit der Daten zu verbessern, da männliche Ratten im Allgemeinen eine stabilere Fluorid-Pharmakokinetik und neurotoxische Reaktionen zeigten. Die Bedeutung von Geschlechtsunterschieden war jedoch unbestreitbar. Bisherige Studien bestätigten, dass Östrogen die Expressionsregulation von miRNAs über Kernrezeptoren (z. B. ERα, ERβ) vermitteln kann ( Klinge , 2020 ) . Beispielsweise kann es die miR-200-Familie hochregulieren, um neuroinflammatorische Reaktionen zu hemmen ( Márton et al., 2020 ), oder die Expression von Genen, die mit der neuronalen Differenzierung in Zusammenhang stehen, über miR-124 regulieren ( Varshney et al., 2017 ). Zukünftige Studien könnten weibliche Ratten einbeziehen, um die geschlechtsspezifischen Regulationsmechanismen, die fluoridinduzierten neurologischen Schäden zugrunde liegen, umfassender aufzuklären. Zweitens wurden zwar mittels Durchflusszytometrie Trends in den Zellapoptoseraten ermittelt, quantitative Techniken wie die TUNEL-Färbung jedoch nicht zur Einzelzelllokalisierung und -zählung eingesetzt. Diese Einschränkung ergibt sich aus dem anfänglichen Fokus der Studie auf das Screening molekularer Marker, wobei die Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie für eine schnelle Datenerfassung priorisiert wurde. Die TUNEL-Färbung erfordert hingegen eine längere Bearbeitungszeit und liefert daher keine direkten morphologischen Belege für den Zusammenhang zwischen Fluoridexposition und neuronaler Apoptose. Darüber hinaus untersuchte die Populationsanalyse lediglich die Korrelation zwischen Fluoridkonzentrationen im Urin und Biomarkern (z. B. miR-23b-5p, BDNF), ohne standardisierte kognitive Funktionstests (z. B. MMSE, MoCA) durchzuführen. Dies ist hauptsächlich auf begrenzte Ressourcen in der Querschnittsstudie und die Schwierigkeit zurückzuführen, groß angelegte Tests innerhalb kurzer Zeit durchzuführen. Da kognitive Funktionsbeurteilungen maßgeblich vom Bildungsniveau und der Mitarbeit der Teilnehmenden beeinflusst werden, priorisierte das Forschungsteam objektive biologische Probenanalysen als primären Endpunkt. Dies führte zu unzureichenden Belegen für einen Zusammenhang zwischen Fluoridexposition und neurologischen Schäden beim Menschen. In den In-vitro-Experimenten wurde lediglich eine Einzeldosis (30 mg/L NaF) verwendet, und die nachgeschalteten regulatorischen Signalwege von miR-23b-5p (z. B. die CREB1/BDNF-Signalachse) wurden nicht untersucht. Zukünftige Studien zielen darauf ab, die Mechanismen durch Mehrfachdosierung und die Identifizierung nachgeschalteter Zielstrukturen genauer zu erforschen.

Zusammenfassend zeigte diese Studie die zentrale regulatorische Rolle von miR-23b-5p bei fluoridinduzierten neurologischen Schäden. Experimentelle Ergebnisse belegten, dass Fluoridexposition die Expression von miR-23b-5p signifikant erhöhte, während gleichzeitig die BDNF-Expression verringert wurde. Der signifikante vermittelnde Effekt von miR-23b-5p zwischen Fluoridexposition und neurologischen Schäden wurde auf Populationsebene bestätigt. Dieser Befund liefert wichtige epidemiologische Belege für die Etablierung von miR-23b-5p als neuem Biomarker für fluoridinduzierte neurologische Schäden. Fluoridinduzierte neurologische Schäden sind ein komplexer Prozess, an dem mehrere Signalwege beteiligt sind. Neben der in dieser Studie aufgezeigten miR-23b-5p/BDNF-Achse bestätigten frühere Untersuchungen, dass auch Signalwege wie RhoA/ROCK ( Chen et al., 2023 ) und oxidativer Stress/JNK ( Liu et al., 2011 ) eine wichtige Rolle spielen. Daher ist miR-23b-5p in diesem komplexen regulatorischen Netzwerk wahrscheinlich eher einer der Schlüsselfaktoren als der alleinige Faktor. Die potenziellen Wechselwirkungen zwischen miR-23b-5p und anderen Signalwegen stellen einen wichtigen Ansatzpunkt für zukünftige Forschung dar.

5. Fazit

Diese Studie zeigte, dass Fluoridexposition durch die Hochregulierung von miR-23b-5p zu fluoridbedingten neurologischen Schäden beiträgt. miR-23b-5p unterdrückt die BDNF-Expression und fördert die Apoptose. Diese Ergebnisse legen nahe, dass miR-23b-5p einer der wichtigsten regulatorischen Faktoren bei fluoridbedingten neurologischen Schäden ist und als potenzieller Biomarker dienen könnte. Da fluoridbedingte neurologische Schäden jedoch ein komplexes Signalnetzwerk involvieren, stellt miR-23b-5p wahrscheinlich nur eine kritische Komponente innerhalb dieses Netzwerks dar. Weitere Studien sind erforderlich, um zusätzliche regulatorische Faktoren zu untersuchen und die molekularen Mechanismen fluoridbedingter neurologischer Schäden vollständig aufzuklären. Diese Studie lieferte neue theoretische Erkenntnisse zu den pathogenen Mechanismen fluoridbedingter neurologischer Schäden und identifizierte potenzielle Zielstrukturen für präventive und therapeutische Strategien.

CRediT-Autorenbeitragserklärung

Wei Huang: Konzeptualisierung, Datenaufbereitung, Untersuchung, Formale Analyse, Methodik. Yunzhu Liu: Verfassen des Originalentwurfs, Überarbeitung und Redaktion. Shuaifei Yang: Überarbeitung und Redaktion. Xirui Feng: Überarbeitung und Redaktion. Jianguo Feng: Überarbeitung und Redaktion. Yuting Jiang: Überarbeitung und Redaktion. Yanhui Gao: Betreuung, Projektleitung, Einwerbung von Fördermitteln.

Interessenerklärung

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Artikel beschriebene Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Nationale Schlüsselprogramm für Forschung und Entwicklung Chinas (Fördernummer 2022YFC2503000 ) unterstützt.

Anhang A. Ergänzungsmaterial

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Datenverfügbarkeit

Die verwendeten Daten sind vertraulich.

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